sử dụng Clohexidine trong nội nha

Vai trò chính của vi sinh vật trong cơ chế bệnh sinh của bệnh lý tủy và quanh chóp đã được chứng minh rõ ràng (Kakehashi và cộng sự 1965, Möller và cộng sự 1981, Sundqvist 1992). Việc loại bỏ vi sinh vật khỏi hệ thống ống tủy bị nhiễm trùng là một nhiệm vụ phức tạp liên quan đến việc sử dụng các kỹ thuật dụng cụ, chế độ bơm rửa và thuốc đặt trong ống tủy khác nhau. Chỉ dùng riêng dụng cụ cơ học sẽ không làm cho hệ thống ống tủy không có vi khuẩn, khi xem xét giải phẫu phức tạp của hệ thống ống tủy (Hess 1925), điều này không có gì đáng ngạc nhiên. Mặt khác, bằng chứng ex vivo và lâm sàng đã chỉ ra rằng dụng cụ cơ học để lại một phần đáng kể thành ống tủy không được tạo hình (Peters et al. 2001) và việc loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn chỉ bằng dụng cụ khó có thể xảy ra (Byström & Sundqvist 1981). Người ta giả định, nhưng chưa chứng minh được, rằng bất kỳ mô tủy nào còn sót lại trong ống tủy đều có thể đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng cho bất kỳ vi sinh vật nào còn lại. Hơn nữa, các mô còn sót lại cũng cản trở tác dụng kháng khuẩn của chất bơm rửa ống tủy và thuốc. Vì vậy, cần phải có một số hình thức bơm rửa và khử trùng để loại bỏ mô còn sót lại và tiêu diệt vi sinh vật. Việc xử lý ống tủy bằng hóa chất có thể được chia tùy ý thành dung dịch bơm rửa, rửa ống tủy và dùng thuốc giữa các lần hẹn. Clorhexidine (CHX) được sử dụng rộng rãi như một chất bơm rửa nội nha và thuốc, nhưng chưa có đánh giá đầy đủ về tài liệu liên quan đến CHX. Vì vậy đề tài này có ý nghĩa, có tính thời sự và đóng góp.

Chlorhexidine là một hợp chất hữu cơ được tạo ra từ phối hợp giữa chlorophenyl và biguanide. 2 đầu này được nối với nhau bởi cầu hexamethylene. Cấu trúc hóa học của chlorhexidine bao gồm một phần hydrophobic (dễ tan trong dầu) và một phần hydrophilic (dễ tan trong nước), cho phép nó dễ dàng hòa tan trong nước hoặc các dung môi hữu cơ. Chlorhexidine có tính bazo với 2 bên cation đầu cầu hexamethylene.

Chlorhexidine là một chất kháng khuẩn rất hiệu quả và được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khỏe. Nó có khả năng tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn gây bệnh, bao gồm cả vi khuẩn Gram âm, Gram dương , nấm và virus, và thường được sử dụng để điều trị bệnh lợi nhuận răng miệng và các vấn đề liên quan đến nó. Thuốc có tính chất kháng khuẩn phổ rộng, giúp ngăn ngừa sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong miệng. Nó có thể được sử dụng như một phương pháp hỗ trợ trong điều trị bệnh răng miệng và giúp giảm viêm và làm giảm sự tích tụ của mảng bám trên răng và nướu.

Chlorhexidine hoạt động bằng cách tấn công và tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trong miệng. Khi sử dụng với liều thấp, nó có khả năng tăng tính thấm của vi khuẩn, kết dính với các tế bào vi khuẩn phá vỡ các liên kết trong tế bào vi khuẩn. Khi dùng với liều cao, các tác nhân kháng khuẩn trong chlorhexidine có thể tấn công gây kết tủa và phá hủy tế bào vi khuẩn, gây ra sự phá vỡ và tổn thương màng tế bào và các cơ chế khác để tiêu diệt vi khuẩn.

Ngoài ra, chlorhexidine còn có khả năng tạo ra một lớp màng bảo vệ trên bề mặt răng và nướu nhờ 2 đầu cation của nó là chlorophenyl và biguanide giúp ngăn ngừa sự tích tụ của mảng bám và vi khuẩn trong miệng. Điều này giúp giảm nguy cơ bị viêm nhiễm và bệnh lợi nhuận răng miệng.

Cấu trúc và cơ chế tác dụng của Clorhexidine

Clorhexidine (CHX) là một bis-guanide cation tổng hợp bao gồm hai vòng 4-cholorophenyl đối xứng và hai nhóm biguanide, được nối với nhau bằng chuỗi hexamethylene trung tâm (Greenstein et al. 1986). CHX là một phân tử kỵ nước và ưa mỡ tích điện dương, tương tác với phospholipid và lipopolysacarit trên màng tế bào của vi khuẩn và sau đó xâm nhập vào tế bào thông qua một số loại cơ chế vận chuyển chủ động hoặc thụ động (Athanassiadis et al. 2007). Hiệu quả của nó là do sự tương tác giữa điện tích dương của phân tử và nhóm phốt phát tích điện âm trên thành tế bào vi sinh vật (Gomes et al. 2003a,b), do đó làm thay đổi trạng thái cân bằng thẩm thấu của tế bào. Điều này làm tăng tính thấm của thành tế bào, cho phép phân tử CHX xâm nhập vào vi khuẩn. CHX là một bazơ và ổn định ở dạng muối. Chế phẩm súc miệng phổ biến nhất là CHX gluconate, hòa tan trong nước và ở độ pH sinh lý, nó dễ dàng phân ly và giải phóng thành phần CHX tích điện dương (Greenstein et al. 1986). Ở nồng độ thấp (0,2%), các chất có trọng lượng phân tử thấp, đặc biệt là kali và phốt pho, sẽ rò rỉ ra khỏi tế bào. Mặt khác, ở nồng độ cao hơn (2%), CHX có tác dụng diệt khuẩn khi xảy ra sự kết tủa của các chất trong tế bào chất, dẫn đến chết tế bào (Gomes et al. 2003a).

Hoạt tính kháng khuẩn

Delany và cộng sự. (1982) đã đánh giá 0,2% CHX-gluconate trong ống tủy bị nhiễm trùng. Các mẫu vi khuẩn được lấy trước, trong, ngay sau và 24 giờ sau khi thiết bị, tưới và dùng thuốc bằng CHX-gluconate hoặc bằng nước muối vô trùng. Có sự giảm đáng kể về số lượng vi sinh vật trong các mẫu được xử lý bằng CHX sau khi thiết bị và bơm rửa. Basson & Tait (2001) đã so sánh hiệu quả ex vivo của canxi hydroxit [Ca(OH)2], iốt kali iodua (IKI) và dung dịch CHX trong việc khử trùng hệ thống ống tủy bị nhiễm Actinomyces israelii. Ống tủy được tiếp xúc với IKI, canxi hydroxit hoặc 2% CHX trong thời gian 3, 7 và 60 ngày. CHX là chất khử trùng duy nhất có thể loại bỏ A. israelii khỏi tất cả các mẫu ở mọi thời điểm trong khi 25% mẫu được xử lý bằng IKI và 50% mẫu được xử lý bằng Ca(OH)2 vẫn có A. israelii sống sót sau khi xử lý . Onçağet al. (2003) đã đánh giá đặc tính kháng khuẩn của 5,25% natri hypochlorite (NaOCl), 2% CHX và 0,2% CHX cộng với 0,2% cetrimide [Cetrexidin (GABA Vebas, San Giuliano Milanese, Italy)] sau 5 phút và 48 giờ ở răng người được nhổ. sau khi kênh rạch bị nhiễm Enterococcus faecalis. CHX 2% và Cetrexidin có hiệu quả chống lại E. faecalis cao hơn đáng kể so với NaOCl 5,25% ở cả hai khoảng thời gian. Hai nghiên cứu (Gomes và cộng sự 2001, Vianna và cộng sự 2004) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn ex vivo chống lại mầm bệnh nội nha ở ba nồng độ (0,2%, 1% vàd 2%) của hai dạng CHX (gel và lỏng) và so sánh chúng với năm nồng độ NaOCl (0,5%, 1%, 2,5%, 4% và 5,25%). Cả hai công thức 2% gel và 2% chất lỏng của CHX đều loại bỏ Staphylococcus aureus và Candida albicans trong vòng 15  giây, trong khi công thức gel tiêu diệt E. faecalis trong vòng 1 min. Tất cả các chất bơm rửa được thử nghiệm đều loại bỏ Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis và Prevotella intermedia trong vòng 15  giây. Thời gian cần thiết để chất lỏng CHX 1,0% và 2,0% tiêu diệt hết vi sinh vật cũng tương tự như thời gian cần thiết để loại bỏ hết NaOCl 5,25%. Những nghiên cứu này xác nhận rằng tác dụng kháng khuẩn có liên quan đến loại, nồng độ và hình thức trình bày của chất bơm rửa cũng như tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với công thức được sử dụng.

Zamany và cộng sự. (2003) đã kiểm tra tác động của việc thêm nước rửa CHX 2% vào quy trình xử lý thông thường. Kết quả của họ cho thấy rằng vi khuẩn có thể nuôi cấy được thu được khi kết thúc chuyến thăm đầu tiên ở một trong các trường hợp CHX, trong khi 7 trong số 12 trường hợp đối chứng không có CHX cho thấy sự tăng trưởng; sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê. Siqueira và cộng sự. (2007) đã so sánh hiệu quả của 2,5% NaOCl và 0,12% CHX như chất bơm rửa trong việc làm giảm vi khuẩn có thể nuôi cấy trong hệ thống ống tủy bị nhiễm trùng của răng bị viêm nha chu quanh chóp. Họ phát hiện ra rằng hai dung dịch này có tác dụng tương đương trong việc loại bỏ vi khuẩn và họ cho rằng cả hai đều có thể được sử dụng làm chất bơm rửa.

Trong một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, Manzur et al. (2007) đã đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của thuốc đặt trong ống tuỷ bằng Ca(OH)2, gel CHX 2% và sự kết hợp của cả hai [Ca(OH)2/CHX] ở răng bị viêm quanh chóp mạn tính. Các mẫu vi khuẩn được lấy từ khu vực phẫu thuật và ống tủy trước và sau khi sửa soạn trong đợt điều trị đầu tiên. Các mẫu tiếp theo được lấy từ các kênh khi bắt đầu cuộc hẹn thứ hai 1 tuần sau đó. Họ kết luận rằng hiệu quả kháng khuẩn của Ca(OH)2, CHX và hỗn hợp Ca(OH)2/CHX là tương đương nhau.

Zerella và cộng sự. (2005) đã nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp vữa Ca(OH)2 trộn trong dung dịch CHX 2% so với dung dịch Ca(OH)2 riêng lẻ trong việc khử trùng hệ thống ống tủy của răng đã trám răng cần phải điều trị lại ống tủy vì kênh rạch lại bị nhiễm trùng. Mười hai (30%) trong số 40 mẫu dương tính với vi khuẩn trước khi trám ống tủy. Thuốc đối chứng đã khử trùng 12 (60%) trong số 20 chiếc răng, trong đó có 2 trong số 4 chiếc răng ban đầu được chẩn đoán mắc bệnh cầu khuẩn đường ruột. Thuốc thử nghiệm đã cho kết quả khử trùng 16 trong số 20 (80%) răng khi bắt đầu lần hẹn thứ ba. Không có chiếc răng nào ban đầu chứa enterococci cho thấy sự phát triển còn lại. Họ kết luận rằng hỗn hợp 2% CHX và bùn Ca(OH)2 có hiệu quả tương đương với dung dịch Ca(OH)2 trong việc khử trùng răng đã trám răng bị nhiễm trùng.

Ercan và cộng sự. (2004) đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của CHX 2% và NaOCl 5,25% trong ống tủy răng cửa và răng tiền hàm bị nhiễm trùng. Họ kết luận rằng cả CHX và NaOCl đều là chất bơm rửa hiệu quả để giảm số lượng vi sinh vật ở răng bị hoại tử tủy, bệnh lý quanh chóp hoặc cả hai.

Tanomaru và cộng sự. (2003) đã đánh giá hiệu quả của việc chuẩn bị cơ sinh học với 5% NaOCl, 2% CHX và dung dịch tưới nước muối sinh lý và băng Ca(OH)2 trong ống tủy răng chó có chứa nội độc tố vi khuẩn. Họ phát hiện ra rằng việc chuẩn bị cơ sinh học bằng dung dịch bơm rửa không làm bất hoạt nội độc tố, nhưng băng nội ống tuỷ bằng canxi hydroxit đã làm bất hoạt các tác động do nội độc tố gây ra in vivo.

Một chủ đề thú vị khác là tác dụng phụ của CHX và hydro peroxide. Heling & Chandler (1998) đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của sự kết hợp bơm rửa trong ống ngà ex vivo chống lại E. faecalis và nhận thấy rằng sự kết hợp cụ thể của 3% hydrogen peroxide (H2O2) và CHX có hoạt tính kháng khuẩn vượt trội ở ngà răng so với các chế độ điều trị khác, chẳng hạn như CHX và NaOCl. Steinberg và cộng sự. (1999) đã thử nghiệm huyền phù E. faecalis trong nước đậu nành trypticase (môi trường nuôi cấy giàu peptide) với nhiều sự kết hợp khác nhau của CHX và H2O2. Các thí nghiệm đã chứng minh rằng sự kết hợp của hai chất đã tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn E. faecalis ở nồng độ thấp hơn nhiều so với nồng độ cần thiết cho riêng từng thành phần. Theo nghiên cứu đó, tác dụng diệt khuẩn của CHX bắt nguồn từ khả năng làm biến tính thành tế bào vi khuẩn đồng thời hình thành các lỗ trên màng, trong khi H2O2 có hiệu quả chống lại các bào quan nội bào, chẳng hạn như DNA. Mặc dù cơ chế hiệp đồng chính xác của CHX và H2O2 chưa được biết đến, nhưng có thể giả định rằng sự tiếp xúc của vi khuẩn với CHX dẫn đến thành tế bào dễ thấm hơn mà H2O2 có thể dễ dàng xâm nhập và do đó làm hỏng các bào quan nội bào (Steinberg et al. 1999). . Shabahang và cộng sự. (2008) đã đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của việc thay thế CHX bằng doxycycline trong MTAD chống lại chủng E. faecalis ex vivo. Tìm thấy Các kết quả cho thấy rằng sự hiện diện của doxycycline ở nồng độ có trong công thức MTAD có hiệu quả trong việc loại bỏ vi khuẩn E. faecalis. Hơn nữa, việc bổ sung 0,2% CHX không ảnh hưởng xấu đến tác dụng kháng khuẩn của doxycycline. Mặt khác, việc thay thế 0,2% CHX không mang lại hiệu quả khử trùng tương tự trên E. faecalis như MTAD.

Nhìn chung, mặc dù các nghiên cứu so sánh tác dụng kháng khuẩn của CHX và NaOCl đã đưa ra những kết quả có phần trái ngược nhau, nhưng có vẻ như khi sử dụng ở nồng độ giống nhau, tác dụng kháng khuẩn của chúng ex vivo (ở ngà răng bị nhiễm trùng) và in vivo (trong hệ thống ống tủy) là tốt hơn. tương tự.

Hoạt tính kháng nấm

Nấm (hoặc nấm men) cấu thành một tỷ lệ nhỏ của hệ vi sinh vật đường miệng thông thường với loài Candida là loại nấm phổ biến nhất hiện diện ở cả người khỏe mạnh (30–45%) và người bị tổn thương về mặt y tế (95%) (Siqueira & Sen 2004). Nấm đôi khi được tìm thấy trong các ống tủy bị nhiễm trùng mà chưa được điều trị nội nha trước đó, nhưng chúng phổ biến hơn ở các ống tủy đã được trám bít ở những răng bị nhiễm trùng một thời gian sau khi điều trị hoặc ở những răng không đáp ứng với điều trị nội nha (23) . Nhìn chung, sự xuất hiện của nấm được báo cáo trong ống tủy bị nhiễm trùng dao động từ 1% đến 17% (Waltimo et al. 2004).

Nấm có thể liên quan đến các trường hợp nhiễm trùng dai dẳng và thứ phát liên quan đến các tổn thương quanh chóp dai dẳng và do đó phổ hoạt tính kháng khuẩn của thuốc nội nha và chất bơm rửa nên bao gồm các sinh vật này. Do đó, các loại thuốc có hiệu quả kháng nấm có thể hỗ trợ kiểm soát thành công các bệnh nhiễm trùng nội nha dai dẳng hoặc thứ phát do nấm gây ra (Siqueira & Sen 2004, Waltimo et al. 2004). Để thử và cải thiện khả năng sát trùng trong chế độ điều trị nội nha một lần, người ta đã đề xuất tưới và/hoặc ‘ngâm’ ống tủy bằng dung dịch CHX hoặc iốt-IKI sau khi tưới bằng NaOCl. Dung dịch CHX dạng nước có phổ hoạt tính kháng khuẩn rộng ở nồng độ thấp và đặc biệt hiệu quả đối với C. albicans. Hơn nữa, nó liên kết với các mô xung quanh và sau đó có thể được giải phóng trở lại từ từ trong thời gian dài, một hiện tượng được gọi là hiện tượng thực chất. Điều thú vị là, CHX có thể ức chế hiệu quả sự bám dính ban đầu và có thể tích lũy thêm cũng như hình thành màng sinh học của nấm và các vi sinh vật khác. Một nghiên cứu lâm sàng gần đây đã chỉ ra rằng các ống tuỷ được rửa lần cuối bằng dung dịch CHX 2% thường không có vi sinh vật nuôi cấy được nhiều hơn đáng kể so với các ống tủy đối chứng chỉ được tưới bằng NaOCl (Siqueira & Sen 2004, Waltimo et al. 2004).

Sen và cộng sự. (1999) đã đánh giá đặc tính kháng nấm của CHX 0,12%, NaOCl 1% và NaOCl 5% đối với Candida albicans bằng mô hình ống ngà răng hình trụ. Họ báo cáo rằng C. albicans có khả năng kháng lại các dung dịch bơm rửa này tốt hơn khi có lớp vết bẩn so với khi không có lớp này. Khi không có lớp phết, NaOCl bắt đầu thể hiện hoạt tính kháng nấm sau 30 phút. Waltimo và cộng sự. (1999) đã đánh giá tính nhạy cảm của bảy chủng C. albicans với bốn chất khử trùng là IKI, CHX-acetate (0,5%), NaOCl (5% và 0,5%) và Ca(OH)2. Mỗi dung dịch đều được thử nghiệm riêng lẻ cũng như theo cặp bằng cách sử dụng tất cả các cặp có thể có của bốn chất khử trùng này. Tất cả các chủng C. albicans được thử nghiệm đều cho thấy độ nhạy cảm tương tự với các loại thuốc này. Chúng có khả năng kháng Ca(OH)2 cao, nhưng NaOCl và IKI đã tiêu diệt tất cả tế bào trong vòng 30  giây và CHX-acetate cho thấy tiêu diệt hoàn toàn sau 5 phút. Sự kết hợp của các chất khử trùng có hiệu quả tương đương hoặc kém hơn so với thành phần hiệu quả hơn của cặp được thử nghiệm.

Siqueira và cộng sự. (2003) đã đánh giá hiệu quả của bốn loại thuốc tiêm trong ống tủy trong việc khử trùng ngà răng ở răng bò bị nhiễm C. albicans thực nghiệm. Trụ ngà răng bị nhiễm trùng đã tiếp xúc với bốn loại thuốc khác nhau: Ca(OH)2/glycerin; Ca(OH)2/0,12%CHX; Ca(OH)2/monoparachlorophenol long não/glycerin và CHX/oxit kẽm 0,12%. Các mẫu được xử lý bằng bột nhão Ca(OH)2/long não monoparachlorophenol/glycerin hoặc bằng bột nhão CHX/kẽm oxit đã được khử trùng hoàn toàn sau 1 h tiếp xúc trong khi bột nhão Ca(OH)2/glycerin đã loại bỏ hoàn toàn C. albicans sau 7 ngày phơi nhiễm. Canxi hydroxit trộn với CHX không có tác dụng khử trùng ngà răng ngay cả sau 1 tuần. Trong một nghiên cứu khác, Siqueira et al. (2001) đã nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của một số loại thuốc chống lại C. albicans, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida parapsilosis và Saccharomyces cerevisiae. Canxi hydroxit trộn với CPMC/glycerin dưới dạng bột nhão cho thấy tác dụng kháng nấm rõ rệt nhất. Canxi hydroxit trong glycerin, Ca(OH)2 với CHX và CHX trong chất tẩy có hoạt tính kháng nấm kém hơn. Ferguson và cộng sự. (2002) đã tìm cách xác định tính nhạy cảm in vitro của C. albicans với các loại chất tưới và thuốc khác nhau. Nồng độ ức chế tối thiểu của NaClOH, hydro peroxit, CHX-digluconat và dung dịch Ca(OH)2. Kết quả của họ cho thấy NaOCl, hydrogen peroxide và CHX-digluconate có hiệu quả chống lại C. albicans ngay cả khi được pha loãng đáng kể. Tuy nhiên, dung dịch Ca(OH)2 không có hoạt tính kháng nấm. Tổng hợp lại có thể kết luận CHX là chất chống nấm hiệu quả nhưng hiệu quả kém hơn đáng kể so với NaOCl.

CHX và màng sinh học

Thuật ngữ màng sinh học được đưa ra để chỉ sự ngưng tụ lớp mỏng của vi khuẩn có thể xảy ra trên các cấu trúc bề mặt khác nhau trong tự nhiên. Vi khuẩn trôi nổi tự do tồn tại trong môi trường nước, được gọi là dạng vi sinh vật phù du, là điều kiện tiên quyết để hình thành màng sinh học (Bowden & Hamilton 1998). Do đó, màng sinh học có thể được hình thành trên bất kỳ chất nền bề mặt hữu cơ hoặc vô cơ nào nơi các vi sinh vật phù du chiếm ưu thế trong dung dịch gốc nước. Trong bối cảnh nha khoa, cấu trúc màng sinh học được biết đến và nghiên cứu rộng rãi được thiết lập trong quá trình vi khuẩn bám vào răng để hình thành mảng bám răng. Ở đây, vi khuẩn không có trong nước bọt (sinh vật phù du) đóng vai trò là nguồn sinh vật chính để tổ chức màng sinh học cụ thể này (Bowden & Hamilton 1998). Trong nội nha, khái niệm màng sinh học ban đầu được thảo luận chủ yếu trong khuôn khổ vi khuẩn trên đầu chân răng có tủy bị hoại tử và nhiễm trùng hoặc hệ thống ống tủy không có tủy và bị nhiễm trùng. Sự tập trung vi khuẩn như vậy được cho là nguyên nhân gây ra bệnh viêm nha chu vùng chóp kháng trị (Tronstad & Sunde 2003). Mặc dù không được mô tả chi tiết nhưng người ta đã quan sát thấy sự ngưng tụ vi khuẩn (tức là màng sinh học) trên thành ống tủy bị nhiễm trùng.

Các chất kháng khuẩn thường được phát triển và tối ưu hóa cho hoạt động của chúng chống lại các quần thể phân tán, đang phát triển nhanh có chứa một vi sinh vật duy nhất. Tuy nhiên, các cộng đồng vi sinh vật phát triển trong màng sinh học rất khó tiêu diệt bằng các chất chống vi trùng và vi sinh vật trong màng sinh học trưởng thành có thể kháng thuốc vì những lý do vẫn chưa được giải thích thỏa đáng (Bowden & Hamilton 1998). Có những báo cáo cho thấy rằng các vi sinh vật phát triển trong màng sinh học có thể có khả năng kháng bệnh cao gấp đôi đến 1000 lần so với dạng sinh vật phù du tương ứng của cùng một sinh vật (Svensater & Bergenholtz 2004). Spratt và cộng sự. (2001) đã đánh giá hiệu quả của 2,25% NaOCl, 0,2% CHX, 10% povidone iốt, 5 ppm keo bạc và dung dịch đệm phốt phát (PBS) như một biện pháp kiểm soát màng sinh học độc canh của năm chủng phân lập ống tủy bao gồm P. intermedia, Peptostreptococcus miros , Streptococcus intermedius, Fusobacteria nucleatum và E. faecalis. Họ báo cáo rằng NaOCl là chất chống vi khuẩn hiệu quả nhất, sau đó là dung dịch iốt. Clegg và cộng sự. (2006) đã đánh giá hiệu quả ex vivo chống lại màng sinh học đỉnh ngà răng với ba nồng độ NaOCl (6%, 3% và 1%), 2% CHX và hỗn hợp thương mại gồm tetracycline, axit và chất tẩy rửa được gọi là BioPure MTAD ( Dentsply, Nha khoa Tulsa, Tulsa, OK, Hoa Kỳ). Họ báo cáo rằng NaOCl 6% và NaOCl 3% có khả năng phá vỡ và loại bỏ màng sinh học, nhưng NaOCl 1% và MTAD có khả năng phá vỡ màng sinh học nhưng không loại bỏ được vi khuẩn. CHX 2% không có khả năng phá vỡ màng sinh học. Không thể nuôi cấy vi khuẩn sống từ các mẫu thử tiếp xúc với 6% NaOCl, 2% CHX hoặc 1% NaOCl, sau đó là BioPure MTAD. Dunavant và cộng sự. (2006) đã đánh giá hiệu quả của 6% NaOCl, 1% NaOCl, Smear Clear™ (SybronEndo, Orange, CA, USA), 2% CHX, REDTA (Roths International Ltd, Chicago, IL, USA) và BioPure™ MTAD™ đối với Màng sinh học E. faecalis sử dụng hệ thống thử nghiệm mới trong phòng thí nghiệm. Màng sinh học phát triển trong hệ thống tế bào dòng chảy được ngâm trong dung dịch tưới thử nghiệm trong 1 hoặc 5 phút. Có một mối quan hệ đáng kể giữa tác nhân thử nghiệm và tỷ lệ tiêu diệt vi khuẩn trong màng sinh học. Không tìm thấy mối quan hệ đáng kể giữa thời gian và tỷ lệ tiêu diệt. Tỷ lệ tiêu diệt vi khuẩn là: 6% NaOCl (>99,99%), 1% NaOCl (99,78%), Smear Clear™ (78,06%), 2% CHX (60,49%), REDTA (26,99%) và BioPure™ MTAD ™ (16,08%). Có sự khác biệt đáng kể giữa NaOCl (cả nồng độ 1% và 6%) và tất cả các tác nhân khác. Do đó, cả NaOCl 1% và NaOCl 6% đều hiệu quả hơn trong việc loại bỏ màng sinh học E. faecalis so với các giải pháp khác được thử nghiệm. Trong một nghiên cứu khác, Lima et al. (2001) đã đánh giá hiệu quả của thuốc dựa trên CHX hoặc kháng sinh (clindamycin và metronidazole) trong việc loại bỏ màng sinh học E. faecalis 1 và 3 ngày. Mỗi màng chứa màng sinh học được phủ kỹ bằng 1 mL thuốc thử nghiệm và ủ trong 1 ngày ở 37 °C. Các màng sinh học đã xử lý sau đó được chuyển vô trùng vào các lọ chứa chất trung hòa trong dung dịch muối và được xoáy. Huyền phù được pha loãng 10 lần, gieo vào các đĩa thạch Mitis Salivarius và đếm các đơn vị hình thành khuẩn lạc sau 48 h ủ. Có sự khác biệt đáng kể giữa đối với các mô phỏng đã được thử nghiệm. Sự kết hợp của clindamycin với metronidazole làm giảm đáng kể số lượng tế bào trong màng sinh học trong 1 ngày. Tuy nhiên, trong số tất cả các loại thuốc được thử nghiệm, chỉ có 2% thuốc chứa CHX có thể loại bỏ triệt để hầu hết các màng sinh học E. faecalis 1 ngày và 3 ngày. Nhìn chung, có vẻ như mặc dù CHX có phần nào hiệu quả chống lại màng sinh học vi khuẩn nhưng NaOCl là giải pháp tưới duy nhất có khả năng phá vỡ màng sinh học.

Tinh ổn định của CHX

Clorhexidine cũng như tetracycline có một đặc điểm độc đáo là ngà răng được tẩm thuốc có khả năng kháng khuẩn (Khademi et al. 2006). Các ion tích điện dương do CHX giải phóng có thể hấp thụ vào ngà răng và ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn trên bề mặt ngà răng trong một khoảng thời gian dài hơn khoảng thời gian áp dụng thuốc thực tế (Athanassiadis et al. 2007).

Tác dụng kháng khuẩn của CHX đã được đánh giá trong một số nghiên cứu nha chu và nội nha. Trong một nghiên cứu nha chu in vivo, Stabholz et al. (1993) đã đánh giá tính ổn định của bề mặt chân răng con người sau khi bơm rửa dưới nướu tại chỗ bằng tetracycline HCL và CHX. Họ phát hiện ra rằng hàm lượng của tetracycline ở mức 50 mg mL/1 lớn hơn đáng kể so với CHX trong 12 ngày và lớn hơn nước muối trong 16 ngày.

Trong một nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, White et al. (1997) đã đánh giá tính kháng khuẩn của dung dịch CHX 2% như một chất bơm rửa nội nha. Các phát hiện cho thấy tác dụng thực sự kéo dài 72h. Trong một nghiên cứu in vivo, Leonardo et al. (1999) đã đánh giá tính kháng khuẩn của CHX 2% được sử dụng làm dung dịch bơm rửa ống tủy ở những răng bị hoại tử tủy và các tổn thương quanh chóp mãn tính có thể nhìn thấy trên X quang. Họ báo cáo rằng CHX ngăn chặn hoạt động của vi khuẩn với các tác động tồn dư trong hệ thống ống tuỷ lên đến 48 h sau khi bôi. Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác đã báo cáo rằng tính thực chất của CHX có thể tồn tại trong thời gian dài hơn. Khademi và cộng sự. (2006) nhận thấy rằng việc sử dụng dung dịch CHX 2% trong 5 phút có hiệu quả kéo dài đến 4 tuần. Rosenthal và cộng sự. (2004) đã đánh giá tính thực tế của dung dịch CHX 2% trong hệ thống ống tủy sau 10 phút áp dụng và họ báo cáo rằng CHX được giữ lại trong ngà răng ống tủy với lượng có hiệu quả kháng khuẩn lên đến 12 tuần.

Khả năng kháng khuẩn phụ thuộc vào số lượng phân tử CHX có sẵn để tương tác với ngà răng. Do đó, bôi thuốc vào ống tủy bằng chế phẩm CHX đậm đặc hơn sẽ làm tăng khả năng chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn. Khả năng kháng khuẩn của ba nồng độ dung dịch CHX (4%, 2% và 0,2%) sau 5 phút sử dụng đã được đánh giá. Kết quả cho thấy mối quan hệ trực tiếp giữa nồng độ CHX và tính chất thực sự của nó (Mohammadi và cộng sự 2008). Ngược lại, Lin và cộng sự. (2003a) cho rằng tính chất thực sự của CHX là do khả năng hấp phụ vào ngà răng trong giờ đầu tiên. Họ tuyên bố rằng chỉ sau khi đạt đến điểm bão hòa sau giờ đầu tiên, khả năng kháng khuẩn của CHX mới tăng theo thời gian. Hơn nữa, Komorowski và cộng sự. (2000) tiết lộ rằng bôi CHX trong 5 phút không mang lại hiệu quả thực sự và ngà răng nên được điều trị bằng CHX trong 7 ngày. Tổng hợp lại, có vẻ như hoạt tính kháng khuẩn còn sót lại của CHX trong hệ thống ống tủy vẫn tồn tại đến 12 tuần.

Tác dụng biến đổi ngà răng của CHX

Môi trường ống tủy là một hỗn hợp phức tạp của nhiều loại hợp chất hữu cơ và vô cơ. Hydroxyapatite, thành phần chính của ngà răng, là đại diện chính cho các thành phần vô cơ có mặt. Ngoài ra, dịch tiết viêm đi vào ống tủy trong nhiễm trùng có mủ rất giàu protein, chẳng hạn như albumin. Tầm quan trọng tương đối của các hợp chất hữu cơ và vô cơ khác nhau trong việc vô hiệu hóa chất khử trùng ống tủy đã được nghiên cứu một cách hạn chế (Haapasalo và cộng sự 2000). Khó khăn trong việc thiết kế các thí nghiệm nhằm cung cấp dữ liệu đáng tin cậy và có thể so sánh được là một trong những thách thức lớn nhất đối với các nhà nghiên cứu trong nhiều năm. Haapasalo và cộng sự. (2000) đã giới thiệu một mô hình bột ngà răng mới để nghiên cứu tác dụng ức chế của ngà răng đối với các loại thuốc và chất bơm rửa ống tủy khác nhau. Họ đã nghiên cứu tác dụng điều chỉnh của ngà răng đối với hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch CA(OH)2 bão hòa, NaOCl 1%, CHX axetat 0,5% và 0,05% và IKI 2/4% và 0,2/0,4%. Bột ngà răng có tác dụng ức chế đối với tất cả các loại thuốc được thử nghiệm. Hiệu quả phụ thuộc vào nồng độ của thuốc cũng như khoảng thời gian ủ thuốc với bột ngà răng trước khi thêm vi khuẩn vào. Tương tự, 0,2/0,4% IKI mất tác dụng sau khi ủ trước 1 h với ngà răng trước khi thêm vi khuẩn vào. Tác dụng của 0,05% CHX và 1% NaOCl đối với E. faecalis bị giảm đi, nhưng không bị loại bỏ hoàn toàn bởi sự hiện diện của ngà răng. Không thể đo được sự ức chế khi dùng dung dịch CHX và IKI có nồng độ đầy đủ đã được sử dụng để tiêu diệt vi khuẩn E. faecalis. Portenier và cộng sự. (2001) đánh giá tác dụng ức chế tác dụng kháng khuẩn của dung dịch Ca(OH)2 bão hòa, CHX-acetate và IKI của ngà răng, hydroxylapatite (HA) và albumin huyết thanh bò (BSA). Canxi hydroxit bị bất hoạt hoàn toàn khi có 28 mg bột ngà răng hoặc BSA. CHX (0,05%) bị ức chế mạnh bởi BSA và bị làm chậm lại bởi ngà răng. Tuy nhiên, HA có ít hoặc không có tác dụng ức chế CHX. Tác dụng kháng khuẩn của IKI 0,2/0,4% đối với E. faecalis bị ức chế hoàn toàn bởi ngà răng (28 mg), nhưng thực tế không bị ảnh hưởng bởi HA hoặc BSA. Việc giảm dần ngà răng từ 28 xuống 2,8 mg 150 μL−1 kéo theo sự giảm tương tự về khả năng ức chế hoạt động kháng khuẩn của CHX. IKI hoàn toàn không bị ức chế với lượng ngà răng <28 mg. Tuy nhiên, ảnh hưởng của dung dịch canxi hydroxit bão hòa đã bị loại bỏ hoàn toàn bởi ngà răng ở cả bốn nồng độ được thử nghiệm. Có thể giả định rằng sự ức chế hoạt động kháng khuẩn của Ca(OH)2, CHX và IKI do ngà răng xảy ra theo các cơ chế khác nhau (Portenier và cộng sự 2001). Điều đáng ngạc nhiên là Ca(OH)2 rất nhạy cảm với tác dụng ức chế của cả ba vật liệu được thử nghiệm. Tất nhiên, sự ức chế Ca(OH)2 của ngà răng và các hợp chất khác phụ thuộc vào mối quan hệ định lượng của chúng (Portenier et al. 2001). Một cơ chế chính chống lại sự sống sót của E. faecalis trong ống tủy chứa đầy Ca(OH)2 có thể là tác dụng đệm của ngà răng chống lại sự tăng pH. HA vô cơ có ít hoặc không có hoạt tính ức chế CHX so với ngà răng, trong khi BSA là chất ức chế CHX mạnh nhất, với hơn 10% tế bào E. faecalis vẫn tồn tại sau 24 h ủ với thuốc. Điều này chỉ ra rằng dịch tiết viêm quanh chóp đi vào ống tủy là mối đe dọa lớn hơn đối với hoạt động của CHX so với thành ngà răng. Bột ngà răng loại bỏ hoàn toàn tác dụng kháng khuẩn của IKI; trong khi thành phần chính của ngà răng là HA không ảnh hưởng đến tác dụng kháng khuẩn của IKI và BSA cũng vậy. Ngoài ra, người ta thường biết rằng máu sẽ nhanh chóng làm bất hoạt hoạt động kháng khuẩn của các hợp chất iốt (Portenier và cộng sự 2001). Trong một nghiên cứu khác, Portenier et al. (2002) đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của CHX và IKI trên E. faecalis với sự có mặt của ngà răng, ma trận ngà răng, ngà răng được xử lý trước bằng axit ethylenediamine tetraacetic (EDTA) và axit xitric, collagen và các tế bào diệt nhiệt của E. faecalis và Candida albicans. Chất nền ngà răng và các tế bào vi sinh vật bị tiêu diệt nhiệt là những chất ức chế CHX hiệu quả nhất, trong khi ngà răng được xử lý trước bằng axit xitric hoặc EDTA chỉ cho thấy sự ức chế nhẹ. Ngà răng và collagen da cho thấy sự ức chế nhất định lúc 1 giờ, nhưng không bị ức chế sau 24 giờ. IKI bị ức chế hiệu quả bởi ngà răng, ma trận ngà răng và các tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt nhiệt. Collagen da và ngà răng được xử lý trước bằng EDTA hoặc axit xitric cho thấy ít hoặc không có tác dụng ức chế IKI. Tác dụng ức chế của ngà răng và BSA đối với hoạt tính kháng khuẩn của CHX và MTAD đã được đánh giá trong một nghiên cứu khác (Portenier et al. 2006). Sự hiện diện của ngà răng hoặc BSA đã gây ra sự chậm tống tủy rõ rệt trong việc tiêu diệt E. faecalis bằng cả hai loại thuốc. Tác dụng ức chế của BSA đối với hoạt tính kháng khuẩn của CHX và NaOCl đã được Sassone et al. (2008). Tổng hợp lại, có vẻ như các thành phần ngà răng, ngà răng (HA và collagen), vi sinh vật bị tiêu diệt và dịch tiết viêm trong hệ thống ống tủy đều làm giảm hoặc ức chế hoạt động kháng khuẩn của thuốc và chất bơm rửa. Nhìn chung, có vẻ như các thành phần ngà răng, ngà răng (HA và collagen), các vi sinh vật bị tiêu diệt và dịch tiết viêm trong hệ thống ống tủy làm giảm hoạt động kháng khuẩn của CHX.

Tác dụng hòa tan mô của CHX

Một số nghiên cứu đã được tiến hành để tìm kiếm chất bơm rửa đáp ứng bốn đặc tính mong muốn chính của chất bơm rửa ống tủy – đó là: hoạt tính kháng khuẩn, không độc hại đối với các mô quanh chóp, khả năng hòa tan trong nước và khả năng hòa tan chất hữu cơ. Do đó, chất bơm rửa lý tưởng nên hòa tan chất hữu cơ bên trong hệ thống ống tủy. Grossman & Meiman (1941) đã chứng minh tầm quan trọng của khả năng dung môi của chất bơm rửa nội nha và nhấn mạnh rằng việc loại bỏ mô tủy khỏi ống tủy là rất quan trọng cho sự thành công cuối cùng của điều trị ống tủy. Moorer & Wesselink (2003) cho thấy độ hòa tan của mô phụ thuộc vào ba yếu tố: tần suất lắc, lượng chất hữu cơ liên quan đến lượng chất bơm rửa trong hệ thống và diện tích bề mặt của mô có thể tiếp xúc với chất bơm rửa. . Okino và cộng sự. (2004) đã đánh giá khả năng hòa tan mô của các dung dịch NaOCl 0,5%, 1,0% và 2,5%, dung dịch nước CHX-digluconate 2%, gel CHX digluconate 2% và nước cất làm đối chứng. Các mảnh bột giấy của bò được cân và cho tiếp xúc với 20 mL mỗi chất được thử nghiệm trong máy ly tâm ở tốc độ 150 rpm cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Tốc độ hòa tan được tính bằng cách chia khối lượng bột giấy theo thời gian hòa tan. Nước cất và cả hai dung dịch CHX đều không hòa tan mô tủy trong vòng 6 giờ. Tốc độ hòa tan trung bình của các dung dịch NaOCl 0,5%, 1,0% và 2,5% lần lượt là 0,31, 0,43 và 0,55 mg phút−1. Trong một nghiên cứu khác, Naenni et al. (2004) đã đánh giá khả năng hòa tan mô hoại tử của 1% (w/v) NaOCl, 10% CHX, 3% và 30% hydrogen peroxide, 10% axit peracetic, 5% dichloroisocyanurate (NaDCC) và 10% axit citric. Các mẫu mô hoại tử đã tiêu chuẩn hóa thu được từ vòm miệng lợn được ủ trong các dung dịch này và mức giảm trọng lượng của chúng được đo theo thời gian. Không có dung dịch thử nghiệm nào ngoại trừ NaOCl có khả năng hòa tan mô đáng kể. Người ta kết luận rằng điều này có thể quan trọng khi xem xét việc sử dụng các chất bơm rửa khác ngoài NaOCl. Nhìn chung, một trong những nhược điểm chính của CHX là nó không có hoạt tính dung môi trong mô.

CHX và Ca(OH)2

Clorhexidine là một biguanide cation có hoạt tính kháng khuẩn tối ưu đạt được trong phạm vi pH từ 5,5–7,0 (Athanassiadis et al. 2007). Do đó, có khả năng việc kiềm hóa độ pH bằng cách thêm Ca(OH)2 vào CHX sẽ dẫn đến kết tủa các phân tử CHX và do đó làm giảm hiệu quả của nó. Người ta đã chứng minh rằng độ kiềm của Ca(OH)2 khi trộn với CHX không thay đổi. Do đó, lợi ích của việc trộn Ca(OH)2 với CHX vẫn chưa rõ ràng và còn gây tranh cãi (Athanassiadis et al. 2007).

Khi được sử dụng làm thuốc đặt trong ống tủy, CHX có hiệu quả hơn Ca(OH)2 trong việc loại bỏ vi khuẩn E. faecalis khỏi bên trong ống ngà (Athanassiadis et al. 2007). Trong một nghiên cứu của Almyroudi et al. (2002), tất cả các công thức CHX được sử dụng, bao gồm hỗn hợp CHX/Ca(OH)2 50:50, đều có hiệu quả trong việc loại bỏ E. faecalis khỏi ống ngà với gel CHX 1% hoạt động tốt hơn một chút so với các chế phẩm khác. Những phát hiện này đã được chứng thực bởi Gomes et al. (2006) ở ngà bò và Schafer & Bossmann (2005) ở ngà người trong đó gel CHX 2% có hoạt tính chống lại E. faecalis mạnh hơn, tiếp theo là CHX/Ca(OH)2 và sau đó chỉ sử dụng Ca(OH)2.

Trong một nghiên cứu sử dụng khuếch tán thạch, Haenni et al. (2003) không thể chứng minh bất kỳ tác dụng kháng khuẩn bổ sung nào bằng cách trộn bột Ca(OH)2 với 0,5% CHX và họ cho thấy CHX có tác dụng kháng khuẩn giảm. Tuy nhiên, Ca(OH)2 không mất đi đặc tính kháng khuẩn trong hỗn hợp như vậy. Điều này có thể là do sự khử proton của CHX ở độ pH>10, làm giảm khả năng hòa tan và làm thay đổi sự tương tác của nó với bề mặt vi khuẩn do điện tích của phân tử bị thay đổi. Trong một nghiên cứu in vitro sử dụng răng người, Ercan et al. (2006) cho thấy gel CHX 2% là tác nhân hiệu quả nhất chống lại E. faecalis bên trong ống ngà, tiếp theo là hỗn hợp Ca(OH)2/2% CHX, trong khi chỉ riêng Ca(OH)2 là hoàn toàn không hiệu quả, ngay cả sau 30  ngày. . Gel CHX 2% cũng hiệu quả hơn đáng kể so với hỗn hợp Ca(OH)2/2% CHX chống lại C. albicans sau 7 ngày, mặc dù không có sự khác biệt đáng kể ở thời điểm 15 và 30 ngày. Riêng Ca(OH)2 hoàn toàn không có hiệu quả đối với C. albicans. Trong một nghiên cứu in vivo khác sử dụng răng sữa, gel CHX-gluconate 1%, cả có và không có Ca(OH)2, có hiệu quả chống lại E. faecalis hơn là CH riêng lẻ trong khoảng thời gian 48 giờ (Oncag et al. 2006) .

Schafer & Bossmann (2005) báo cáo rằng 2% CHX-gluconate có hiệu quả chống lại E. faecalis cao hơn đáng kể so với Ca(OH)2 được sử dụng riêng lẻ hoặc hỗn hợp cả hai. Điều này cũng đã được xác nhận bởi Lin et al. (2003b) mặc dù trong nghiên cứu của Evans et al. (2003) sử dụng ngà bò, CHX 2% với Ca(OH)2 cho thấy hiệu quả hơn Ca(OH)2 trong nước. Trong một nghiên cứu trên động vật, Lindskog et al. (1998) báo cáo rằng răng được bọc CHX trong 4 tuần đã làm giảm các phản ứng viêm ở nha chu (cả ở phần chóp và phần rìa) và khả năng tiêu chân răng ít hơn. Waltimo và cộng sự. (1999) báo cáo rằng CHX-acetate 0,5% có hiệu quả tiêu diệt C. albicans hơn Ca(OH)2 bão hòa, trong khi Ca(OH)2 kết hợp với CHX có hiệu quả hơn Ca(OH)2 khi sử dụng riêng lẻ. Độ pH cao của Ca(OH)2 không bị ảnh hưởng khi kết hợp với CHX trong nghiên cứu này. Tổng hợp lại, có vẻ như lợi ích của việc trộn Ca(OH)2 với CHX vẫn chưa rõ ràng và còn gây tranh cãi.

CHX và sự xâm nhập qua cổ răng của vi khuẩn

Do tính chất kháng khuẩn của nó, có vẻ như chế phẩm CHX làm chậm sự xâm nhập của vi khuẩn qua phần thân răng vào hệ thống ống tủy. Trong một nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, Gomes et al. (2003b) đã nghiên cứu thời gian cần thiết để tái nhiễm khuẩn hệ thống ống tủy răng với phục hình thân răng được điều trị bằng canxi hydroxit, gel CHX 2% hoặc kết hợp cả hai. Các ống tủy không được phục hồi thân răng nhưng được điều trị bằng CHX cho thấy sự tái nhiễm sau thời gian trung bình là 3,7 ngày; nhóm có Ca(OH)2 sau 1,8 ngày và nhóm có CHX+Ca(OH)2 sau 2,6 ngày. Các ống tủy được điều trị bằng CHX và được phục hồi bằng IRM cho thấy tái nhiễm trong vòng 13,5 ngày; nhóm có Ca(OH)2+IRM sau 17,2 ngày và nhóm có CHX+ Ca(OH)2+IR sau 11,9  ngày. Nhóm không dùng thuốc nhưng được phục hồi bằng IRM cho thấy tình trạng tái nhiễm sau thời gian trung bình là 8,7 ngày. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm (P < 0,05). Tất cả các nhóm không được phục hồi thân răng đều bị tái nhiễm nhanh hơn đáng kể so với những nhóm được phục hồi bằng IRM, ngoại trừ những răng đã được phục hồi nhưng không dùng thuốc. Các nhóm dùng thuốc nội tủy và phục hồi thân răng không khác biệt đáng kể với nhau.

Vivacqua-Gomes và cộng sự. (2002) đã đánh giá sự thâm nhập của thuốc nhuộm vành ex vivo vào răng người đã nhổ sau khi điều trị tủy răng bằng cách sử dụng 1% NaOCl + 17% EDTA, 2% CHX gel, 2% CHX gel + 1% NaOCl và nước cất. Sau khi trám bít ống tủy, răng được ủ ở 37 °C trong 10 ngày, sau đó ngâm trong nước bọt người 10 ngày và thêm 10 ngày trong mực Ấn Độ. Răng đã được làm sạch và độ sâu thâm nhập thuốc nhuộm tối đa được xác định bằng kỹ thuật số tính bằng milimét. Kết quả cho thấy độ thấm thuốc nhuộm ít nhất xảy ra với 1% NaOCl + 17% EDTA và 2% CHX gel. NaOCl, nước cất và gel CHX 2% + 1% NaOCl có khả năng thẩm thấu thuốc nhuộm nhiều hơn với sự khác biệt đáng kể so với NaOCl + 17% EDTA và gel CHX 2% và so với nhau.

Các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng chất bơm rửa nhớt, bao gồm cả những chất có chứa CHX gluconate, là những chất ít hòa tan hơn và chúng có thể để lại cặn trên bề mặt ống tủy, có thể ảnh hưởng đến việc trám bít ống tủy. Lambrianidis và cộng sự. (2006) đã nghiên cứu hiệu quả của việc loại bỏ gel Ca(OH)2/CHX, dung dịch Ca(OH)2/CHX và bột nhão Ca(OH)2/nước muối bằng cách sử dụng thiết bị và tưới bằng dung dịch NaOCl và EDTA. Không có kỹ thuật nào được sử dụng trong nghiên cứu này loại bỏ thuốc điều trị tủy giữa các lần hẹn một cách hiệu quả (Lambrianidis et al. 2006). Nhìn chung, hỗn hợp Ca(OH)2/CHX (gel) có lượng dư lượng lớn hơn đáng kể, trong khi hỗn hợp Ca(OH)2/CHX có ít dư lượng hơn hai loại thuốc còn lại. Khi tất cả các nghiên cứu này được xem xét, có vẻ như CHX được sử dụng làm thuốc và/hoặc chất bơm rửa trong ống tủy có thể trì hoãn sự tái nhiễm của hệ thống ống tủy qua đường vành vì tính thực chất của nó. Nhìn chung, do tính chất thực tế của nó, CHX như một loại thuốc/chất bơm rửa trong ống tủy làm trì hoãn sự tái nhiễm của hệ thống ống tủy thông qua đường thân răng.

CHX và thâm nhập dịch qua chóp chân răng

Marley và cộng sự. (2001) đã đánh giá tác dụng của CHX-gluconate 0,12% như một dung dịch bơm rửa nội nha trên việc trám bít chóp của các ống tuỷ được trám bít bằng cách sử dụng ba loại xi măng khác nhau (Roth’s 801, AH26 và Sealapex). Ở thời điểm 90 và 180 ngày sau khi trám chân răng, độ thâm nhập của dịch đỉnh được đo bằng phương pháp lọc dịch. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể liên quan đến chất bơm rửa ở cả hai giai đoạn quan sát 90 và 180 ngày. Hơn nữa, cùng một nhóm đã báo cáo rằng trong thời gian dài (270 và 360 ngày), chất bơm rửa CHX-gluconate không ảnh hưởng xấu đến sự thâm nhập chóp của dịch với các loại xi măng ống tủy khác nhau (Ferguson và cộng sự 2003). Wuerch và cộng sự. (2004) đã nghiên cứu ảnh hưởng của CHX gel và Ca(OH)2 đến việc trám bít ống tủy. Họ báo cáo rằng gel CHX 2% và bột Ca(OH)2 không ảnh hưởng xấu đến chất trám chóp. Những phát hiện này cũng được xác nhận bởi Engel et al. (2005). Nhìn chung, có vẻ như việc dùng thuốc và/hoặc bơm rửa bằng CHX không ảnh hưởng xấu đến khả năng trám răng trong việc ngăn chặn chất lỏng xâm nhập vào hệ thống ống tủy qua lỗ chóp.

Tương tác giữa CHX và NaOCl

Một phác đồ lâm sàng được đề xuất bởi Zehnder (2006) để điều trị ngà răng trước khi hàn ống tủy bao gồm tưới bằng NaOCl để hòa tan các thành phần hữu cơ, tưới bằng EDTA để loại bỏ lớp mùn và tưới bằng CHX để tăng phổ hoạt động kháng khuẩn và để truyền đạt tính thực chất. Mặc dù sự kết hợp các chất bơm rửa như vậy có thể nâng cao hiệu quả kháng khuẩn tổng thể (Kuruvilla & Kamath 1998), nhưng những tương tác hóa học có thể xảy ra giữa các chất bơm rửa phải được xem xét. Một số nghiên cứu đã báo cáo sự xuất hiện của sự thay đổi màu sắc và kết tủa khi NaOCl và CHX kết hợp với nhau (Vivacqua-Gomes và cộng sự 2002, Zehnder 2006, Basrani và cộng sự 2007). Hơn nữa, người ta lo ngại rằng sự thay đổi màu sắc có thể có một số liên quan về mặt lâm sàng do sự nhuộm màu và chất kết tủa có thể cản trở việc bịt kín phần ống tủy (Vivacqua-Gomes et al. 2002). Sự hình thành kết tủa có thể được giải thích bằng phản ứng axit-bazơ xảy ra khi NaOCl và CHX trộn lẫn với nhau. CHX, axit dicic có khả năng cho proton trong khi NaOCl có tính kiềm và có thể nhận proton từ axit dicic. Sự trao đổi proton này dẫn đến sự hình thành một chất trung tính và không hòa tan, được gọi là ‘kết tủa’ (Basrani et al. 2007). Basrani và cộng sự. (2007) đã đánh giá bản chất hóa học của kết tủa này và báo cáo rằng có tác dụng ngay lập tức. phản ứng khi kết hợp CHX 2% với NaOCl ngay cả ở nồng độ thấp (0,023%). Việc tăng nồng độ NaOCl lên 0,19% (độ pha loãng thứ sáu trong chuỗi của chúng) dẫn đến sự hình thành kết tủa, bao gồm chủ yếu là para-chloroaniline (PCA). Điều này xảy ra thông qua sự thay thế nhóm guanidine trong phân tử CHX. Họ phát hiện ra rằng lượng PCA trực tiếp tăng lên khi nồng độ NaOCl ngày càng tăng. PCA đã được chứng minh là độc hại khi con người tiếp xúc với PCA trong thời gian ngắn dẫn đến chứng xanh tím, đây là biểu hiện của sự hình thành methemoglobin. Trong một nghiên cứu khác, Bùi et al. (2008) đã đánh giá hiệu quả của việc bơm rửa ống tủy bằng sự kết hợp của NaOCl và CHX trên ngà răng và ống ngà bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử quét môi trường (FEI Quanta 200, Hillsboro, OR, USA) và chương trình máy tính (photoshop cs2, Adobe Hệ thống, San Jose, CA, Hoa Kỳ). Phát hiện của họ chỉ ra rằng không có sự khác biệt đáng kể về lượng mảnh vụn còn lại giữa nhóm đối chứng âm tính và nhóm thử nghiệm mặc dù có ít ống sáng chế hơn đáng kể ở nhóm thử nghiệm khi so sánh với nhóm đối chứng âm tính. Họ kết luận rằng kết tủa NaOCl/CHX có xu hướng làm tắc các ống ngà và gợi ý rằng cho đến khi kết tủa này được nghiên cứu sâu hơn, cần thận trọng khi bơm rửa bằng cả NaOCl và CHX. Khi kết hợp với nhau, sự kết hợp của NaOCl và CHX gây ra sự thay đổi màu sắc và hình thành kết tủa trung tính và không hòa tan, có thể cản trở khả năng bịt kín của ống tủy cây. Nên sử dụng một lượng lớn chất bơm rửa CHX để tránh làm răng bị đổi màu do kết tủa này. Ngoài ra, ống tủy có thể được làm khô bằng cách sử dụng đầu giấy trước khi rửa CHX lần cuối (Zehnder 2006).

Liên kết CHX và ngà răng (hoạt tính chống tiêu hủy collagen)

Trong hai thập kỷ qua, những tiến bộ về hóa học và kỹ thuật đã góp phần làm tăng độ bền liên kết giữa nhựa và ngà. Tuy nhiên, sự mất đi độ bền liên kết sớm là một trong những vấn đề vẫn ảnh hưởng đến việc phục hồi chất kết dính (Mjör và cộng sự 2000) và làm giảm rõ rệt độ bền của chúng (Carrilho và cộng sự 2005b, De Munck và cộng sự 2005, Frankenberger và cộng sự 2005) . Sự mất đi độ bền liên kết chủ yếu là do sự xuống cấp của lớp lai ở bề mặt ngà răng-dính. Nhiều ấn phẩm đã chứng minh sự thiếu ổn định của trái phiếu này (Wang & Spencer 2003, 2005, Yiu và cộng sự 2004, Carrilho và cộng sự 2005a). Quan điểm cho rằng sự thoái hóa của các sợi collagen trong ngà răng góp phần vào cơ chế gây ra sự thoái hóa liên kết đã được báo cáo (Hashimoto và cộng sự 2003, Pashley và cộng sự 2004). Trong bối cảnh này, người ta đã suy đoán rằng gradient nồng độ khuếch tán monome nhựa giảm dần trong ngà răng bị axit ăn mòn và quá trình rửa giải nhựa tiếp theo từ hydrogel polyme không ổn định thủy phân trong các lớp lai (Wang & Spencer 2003) khiến các sợi collagen không được bảo vệ và dễ bị tổn thương. bị thoái hóa bởi metallicoproteinase nội sinh (MMP). MMP là một nhóm gồm 23 enzyme của động vật có vú có khả năng phân hủy tất cả các thành phần ma trận ngoại bào. Ngà răng của con người chứa ít nhất collagenase (MMP-8), gelatinase MMP-2 và -9 và menysin MMP-20 (Martin-De Las Heras và cộng sự 2000, Sulkala và cộng sự 2002, 2007, Mazzoni và cộng sự 2006). Các hoạt động phân hủy collagen và gelatin hóa ngà răng (Pashley và cộng sự 2004) có thể bị ức chế bởi các chất ức chế protease (Pashley và cộng sự 2004), cho thấy rằng sự ức chế MMP có thể có lợi trong việc bảo tồn các lớp lai. Điều này đã được chứng minh trong một nghiên cứu in vivo, trong đó việc áp dụng CHX, được biết là có tác dụng ức chế MMP phổ rộng (Gendron và cộng sự 1999), đã cải thiện đáng kể tính toàn vẹn của lớp lai trong thử nghiệm lâm sàng kéo dài 6 tháng (Hebling và cộng sự 2005). Carrilho và cộng sự. (2007a) đã đánh giá tác động của CHX lên độ ổn định liên kết nhựa-ngà ex vivo. Kết quả cho thấy với CHX, độ bền liên kết được duy trì tốt hơn đáng kể sau 6 tháng và các chất ức chế protease trong môi trường bảo quản không có tác dụng. Phân tích lỗi cho thấy tỷ lệ lỗi ở lớp lai có CHX ít hơn đáng kể so với nhóm đối chứng sau 6 tháng. Hơn nữa, họ đã đánh giá tác dụng của CHX đối với việc bảo tồn lớp lai trong cơ thể. Các phát hiện cho thấy độ bền liên kết vẫn ổn định ở các mẫu được xử lý CHX, trong khi độ bền liên kết giảm đáng kể ở các răng đối chứng. Ngà răng được thấm nhựa trong các mẫu được xử lý CHX cho thấy tính toàn vẹn cấu trúc bình thường của mạng lưới collagen. Ngược lại, sự phân hủy dần dần của mạng lưới sợi được xác định trong các mẫu đối chứng. Họ kết luận rằng quá trình tự phân hủy của chất nền collagen có thể xảy ra ở ngà răng được thấm nhựa, nhưng có thể được ngăn chặn bằng cách sử dụng chất ức chế protease tổng hợp, chẳng hạn như CHX (Carrilho và cộng sự 2007b). Nhìn chung, do tác dụng ức chế MMP phổ rộng, CHX có thể cải thiện đáng kể độ bám dính nhựa-ngà.dính ổn định Độc tính gây độc tế bào của CHX

Kết quả từ một nghiên cứu về tác dụng gây độc tế bào của chlorehexidine đối với nguyên bào sợi phôi ở chó và Staphylococcus aureus cho thấy nồng độ CHX diệt khuẩn có thể gây chết nguyên bào sợi phôi ở chó trong khi nồng độ không gây độc tế bào cho phép vi khuẩn sống sót đáng kể (Sanchez et al. 1988). Trong một nghiên cứu của Tatnall et al. (1990), tác dụng gây độc tế bào của CHX, hydro peroxide và NaOCl đã được kiểm tra trên các nguyên bào sợi được nuôi cấy ở người, các tế bào sừng cơ bản và dòng tế bào sừng đã biến đổi (tế bào SVK 14). Ở nồng độ được khuyến nghị để làm sạch vết thương, tất cả các chất đều có khả năng tiêu diệt 100% tất cả các loại tế bào. So sánh nồng độ ED50 của từng chất trên tất cả các loại tế bào cho ra thứ tự xếp hạng về độc tính cho thấy CHX là chất khử trùng ít độc nhất.

Kết quả từ một nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về độc tính của CHX đối với tế bào nướu của con người cho thấy hiệu lực độc hại của CHX phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc và thành phần của môi trường tiếp xúc (Babich et al. 1995). Việc bổ sung huyết thanh bào thai bò, albumin, lecithin và Escherichia coli diệt nhiệt làm giảm độc tính tế bào của CHX, có lẽ là do sự liên kết của CHX cation với các gốc/vị trí hóa học tích điện âm của các thành phần/vi khuẩn này (Babich et al. 1995). ). Những phát hiện này gợi ý rằng những phản ứng tương tự trong ống tủy có thể làm giảm khả năng xảy ra phản ứng độc tế bào ở mô quanh chóp (Boyce et al. 1995). Boyce và cộng sự. (1995) nhận thấy CHX (0,05%) độc hại đồng đều đối với cả tế bào người nuôi cấy và vi sinh vật. Agarwal và cộng sự. (1997) phát hiện ra rằng CHX nhanh chóng phá vỡ màng tế bào của cả bạch cầu trung tính trong máu kẽ và ngoại vi ở nồng độ trên 0,005% trong vòng 5 phút, cho thấy tác dụng ức chế của nó đối với chức năng bạch cầu trung tính chủ yếu là do đặc tính tiêu hủy của nó. Yesilsoy và cộng sự. (1995) đã đánh giá tác dụng độc hại ngắn hạn của CHX trong mô dưới da của chuột lang và nhận thấy tình trạng viêm mức độ vừa phải xuất hiện sau 2 ngày, sau đó là sự hình thành u hạt ở cơ thể lạ sau 2 tuần. Ribeiro và cộng sự. (2005) đã đánh giá độc tính gen (tiềm năng gây tổn hại cho DNA) của formocresol, paramonochlorophenol, canxi hydroxit và CHX đối với tế bào buồng trứng của chuột đồng Trung Quốc. Kết quả cho thấy không có tác nhân nào được đề cập góp phần gây tổn hại DNA. Tổng hợp lại, ở nồng độ được sử dụng trên lâm sàng, khả năng tương thích sinh học của CHX là có thể chấp nhận được. Các tương tác có khả năng gây độc giữa CHX và NaOCl đã được xem xét trước đây.

Phản ứng dị ứng với CHX

Mặc dù độ nhạy cảm với CHX rất hiếm nhưng viêm da tiếp xúc là phản ứng bất lợi thường gặp đối với CHX (Krautheim và cộng sự 2004). Ngoài ra, CHX có thể có một số tác dụng phụ hiếm gặp, chẳng hạn như viêm nướu bong tróc, đổi màu răng và lưỡi hoặc rối loạn vị giác (méo vị giác). Tiếp xúc với kết mạc có thể gây tổn thương vĩnh viễn và vô tình tiếp xúc với màng nhĩ có thể gây nhiễm độc tai (Dukes 1992). Các phản ứng dị ứng khác nhau với CHX đã được mô tả. Độ nhạy tiếp xúc với CHX được báo cáo lần đầu tiên bởi Calnan (1962). Ngày nay, CHX được biết là có tác dụng gây viêm da tiếp xúc dị ứng, bao gồm cả viêm da tiếp xúc liên kết đôi, thường sau khi sử dụng kéo dài và lặp đi lặp lại (Krautheim và cộng sự 2004). Nó cũng có thể gây nổi mày đay khi tiếp xúc, nhạy cảm với ánh sáng, phát ban do thuốc cố định và hen suyễn nghề nghiệp. Những người có nguy cơ dị ứng tiếp xúc đặc biệt (ngoài nhân viên y tế và nha khoa) là những bệnh nhân bị loét chân và chàm ở chân (Krautheim et al. 2004). Nhìn chung, độ nhạy cảm khi tiếp xúc với CHX dường như hiếm khi xảy ra vì một số nghiên cứu lớn đã cho thấy tỷ lệ mẫn cảm khoảng 2% (Osmundsen 1982, Bechgaard và cộng sự 1985, Nomura và cộng sự 1989). Thậm chí còn hiếm hơn các báo cáo về phản ứng phản vệ ngay lập tức do CHX. Ohtoshi và cộng sự. (1986) đã chứng minh kháng thể IgE trong huyết thanh của bệnh nhân bị sốc phản vệ do CHX. Việc bôi CHX lên vùng da nguyên vẹn có thể gây phản ứng dị ứng ngay lập tức, chẳng hạn như nổi mề đay, phù Quincke hoặc khó thở và rất hiếm khi có phản ứng phản vệ nghiêm trọng (Torricelli & Wüthrich 1996, Snellman & Rantanen 1999). Những báo cáo về phản ứng với CHX chỉ ra rằng những người hành nghề phải luôn nhận thức được nguy cơ tiềm ẩn này khi sử dụng CHX. Nhìn chung, mặc dù độ nhạy cảm với CHX rất hiếm nhưng biến chứng này cần được lưu ý khi áp dụng CHX.

Nghiên cứu tổng quan 2008 ”The properties and applications of chlorhexidine in endodontics” kết luận:

1. CHX có phạm vi hoạt động rộng chống lại cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm.
2. CHX là một chất chống nấm hiệu quả, đặc biệt là chống lại C. albicans.
3. Tác dụng của CHX đối với màng sinh học vi sinh vật ít hơn đáng kể so với NaOCl.
4. CHX có tác dụng kháng khuẩn ở ngà răng lên đến 12 tuần.
5. Ngà răng, các thành phần ngà răng (HA và collagen), vi sinh vật bị tiêu diệt và dịch tiết viêm trong hệ thống ống tủy có thể làm giảm hoặc ức chế hoạt tính kháng khuẩn của CHX.
6. CHX có rất ít hoặc không có khả năng hòa tan các mô hữu cơ.
7. Trộn CHX với Ca(OH)2 có thể tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của nó.
8. Dùng thuốc và/hoặc bơm rửa bằng CHX có thể trì hoãn sự nhiễm bẩn của răng đã trám răng do vi khuẩn xâm nhập qua bề mặt răng/phục hồi thân răng.
9. Dùng thuốc và/hoặc bơm rửa bằng CHX sẽ không ảnh hưởng xấu đến sự xâm nhập của chất lỏng qua lỗ chóp được lấp đầy chân răng.
10. Sự kết hợp của NaOCl và CHX gây ra sự thay đổi màu sắc và hình thành kết tủa, có thể cản trở việc bịt kín ống tủy.
11. CHX có thể cải thiện đáng kể tính toàn vẹn của lớp lai và độ ổn định liên kết giữa nhựa và ngà răng.
12. Khả năng tương thích sinh học của CHX là chấp nhận được.
13. Trong một số ít trường hợp, CHX có thể gây phản ứng dị ứng.

Tác dụng phụ của chlorhexidine:

Đổi màu nâu răng và lưng lưỡi: Khi sử dụng thuốc với thời gian kéo dài có thể gây ra tình trạng này.

Thay đổi hệ thống vi khuẩn trong miệng.

Khô miệng: Chlorhexidine có thể làm giảm lượng nước bọt trong miệng và gây ra cảm giác khô miệng.

Biến đổi vị giác: Chlorhexidine có thể làm thay đổi vị giác thường không cảm nhận được độ mặn của thức ăn, cảm giác thức ăn nhạt nhẽo.

Tích tụ cao răng: Chlorhexidine có thể gây ra tích tụ cao trên răng do làm lắng đọng protein nước bọt và tăng độ dính trên răng.

Làm mỏng biểu mô: Chlorhexidine có thể làm mỏng, tổn thương biểu mô khi sử dụng với nồng độ cao.

Viêm loét miệng: Sử dụng chlorhexidine trong thời gian dài và không đúng cách có thể gây ra viêm loét miệng, biến đổi tế bào và sự thay đổi vi khuẩn hữu ích trong miệng.

Kích thích tuyến nước bọt mang tai.

Trong 1 nghiên cứu của Trần Thị An Huy 2018

– Có 45 loài vi khuẩn đã được phát hiện trong ống tủy răng VQCMT,

Streptococcus sanguinis chiếm tỷ lệ cao nhất là 49,1%. Streptococcus salivarius là 19,6% Veillonella parvula chiếm 17,6%. Enterococcus faecalis chiếm tỷ lệ 40% trong các răng đã điều trị tủy thất bại có VQCMT.

– Vi khuẩn kỵ khí tùy tiện chiếm tỷ lệ cao nhất 78,4%; kỵ khí tuyệt đối:

11,8%, hiếu khí: 9,8%. Vi khuẩn gram dương: 66%, kỵ khí tùy tiện gram dương: 90,1% 120

– Trong 25 chi vi khuẩn có trong ống tủy, Streptococcus và Actinomyces

chiếm tỷ lệ cao nhất: 78,4%; 23,5%.

– Streptococcus; Bacillus; Haemophylus; Actinomyces; Neisseria có mặt

trong ống tủy răng viêm quanh cuống mạn thì 75% các răng đó sưng đau.

– Số lượng vi khuẩn trung bình của một chi vi khuẩn trong một ống tủy cao

nhất là 1,5×105 CFU/ml, thấp nhất là 1× 103 CFU/ml

– Số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 răng VQCM trước điều trị nội nha

ở răng cửa, răng nanh là 2,0×105 CFU/ml vi khuẩn; ở răng hàm nhỏ: 2,2×105

CFU/ml.

– Sau tạo hình và bơm rửa ống tủy bằng natri hypoclorit, số lượng vi khuẩn

giảm xuống chỉ còn 7,2×104 CFU/ml vi khuẩn ở răng cửa, răng nanh và 8,3×104 CFU/ml ở răng hàm nhỏ. Sự khác biệt về số lượng vi khuẩn trước tạo hình và sau tạo hình ống tủy có ý nghĩa thống kê với p<0,05.

– Sau khi đặt calcium hydroxide có 29,41% số răng đã âm tính với vi khuẩn,

13,72% số răng có giảm số lượng vi khuẩn, 37,25% răng có số vi khuẩn trong ống tủy giảm cả về số lượng và số loài.

Metagenomics là việc giải trình tự và phân tích DNA của các vi sinh vật lấy từ môi trường mà không cần nuôi cấy chúng. Metagenomics còn được biết đến như là “hệ gene cộng đồng” hay “hệ gene môi trường”.

Hiện nay, chúng ta có rất ít thông tin về đại đa số các vi sinh vật hiện diện trong các môi trường khác nhau trên trái đất, chủ yếu là do chúng ta không thể nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm – người ta ước lượng được rằng, dưới 1% của tất cả các loài vi khuẩn được nuôi cấy. Trong thời gian qua, chúng ta không nuôi cấy các vi sinh vật được là do thiếu kiến thức về sinh lý học của chúng và các tín hiệu môi trường mà dựa vào đó chúng ta có thể thiết kế môi trường nuôi cấy phù hợp, tuy nhiên các công nghệ nuôi cấy mới bắt đầu giải quyết những vấn đề này (Zengler, Walcher et al., 2005). Tuy nhiên, hầu hết tri thức của chúng ta được thu lượm từ một phần nhỏ vi sinh vật được phân lập. Nó giống như thầy bói mù sờ voi, sờ thấy chân voi thì bảo voi là cái cột.

Metagenomics cho phép chúng ta nghiên cứu các vi sinh vật bằng cách giải mã thông tin di truyền của chúng từ DNA mà được trích rút trực tiếp từ các cộng đồng của các vi sinh vật môi trường, do đó từng bước vượt qua sự cần thiết của việc phân lập hay nuôi cấy.  Môn học này được xây dựng trên những thành công của các cuộc nghiên cứu 16S rRNA các mẫu môi trường nuôi cấy độc lập (Olsen, Lane et al., 1986). Nó cung cấp những hiểu biết về lịch sử tiến hóa cũng như các khả năng chưa biết từ trước của cộng đồng vi sinh vật chuyên sống trong môi trường. Đó là, các câu hỏi sau có thể được giải đáp “vi sinh vật nào ở đó?”, “vi sinh vật đang làm gì?” và “vi sinh vật hoạt động như thế nào?”. Kết quả phong phú của gene và cấu trúc phân tử được giải mã từ các vi sinh vật ko nuôi cấy được có tiềm năng to lớn trong sự phát triển chất xúc tác sinh học (biocatalysts) mới cho ứng dụng công nghiệp và dược phẩm.

Có nhiều nghiên cứu điều trị viêm quanh chóp chân răng mạn tính bằng các vật liệu khác nhau, nhưng ít nghiên cứu sử dụng giải trình tự và phân tích DNA của các vi sinh vật lấy từ môi trường mà không cần nuôi cấy chúng. (Metagenomics) vì vậy đề tài không trùng lặp

Metagenomics là nghiên cứu về metagenomes, nhằm thu vật liệu di truyền trực tiếp từ các mẫu trong môi trường. Lĩnh vực rộng lớn này có thể được hiểu là di truyền học môi trường, di truyền học sinh thái hay di truyền học quần xã. Nếu như di truyền học và vi sinh vật học truyền thống giải trình tự bộ gen (genome sequencing) của vi sinh vật dựa trên mẫu là các mẫu dòng đã nuôi cấy, thì ngay từ những nghiên cứu đầu tiên, di truyền học môi trường đã nhân dòng các đoạn trình tự gen đặc hiệu (thường là gen 16S rRNA) để xây dựng dữ liệu về đa dạng sinh học của các mẫu môi trường. Với những nghiên cứu bước đầu đó, người ta đã nhận ra rằng nếu chỉ tiếp tục nghiên cứu theo kiểu truyền thống thì sẽ không thể tìm hiểu về sự đa dạng sinh học của vi sinh vật được.^[1] Những nghiên cứu metagenomics gần đây thường thực hiện bằng phương pháp Sanger (“shotgun” Sanger sequencing), hoặc song song với phương pháp pyrosequencing để có các mẫu của tất cả các gen từ mỗi cá thể trong quần xã mẫu.^[2] Chính vì vai trò quan trọng trong việc khám phá đa dạng vi sinh vật mà metagenomics có thể được coi như một lăng kính giúp ta hiểu hơn về thế giới của các sinh vật nhỏ bé.

Thuật ngữ “metagenomics” được giới thiệu bởi Jo Handelsman, Jon Clardy, Robert M. Goodman và một số người khác, và xuất hiện lần đầu trong một bài báo vào năm 1998.^[3] Thuật ngữ metagenome phản ánh ý tưởng về bộ sưu tầm các gen được giải mã trực tiếp từ môi trường với cách tương tự như nghiên cứu về từng genome. Kevin Chen and Lior Pachter (University of California, Berkeley) đã định nghĩa metagenomics là ” việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong nghiên cứu về quần xã vi sinh vật một cách trực tiếp trong môi trường tự nhiên của chúng mà không cần phải phân lập và nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm”.^[4]

Việc giải trình tự theo kiểu truyền thống thường bắt đầu bằng việc nuôi cấy các tế bào giống hệt nhau để làm nguồn phân lập DNA. Các nghiên cứu metagenomic đã cho thấy vẫn còn rất nhiều nhóm vi sinh vật trong tự nhiên mà chúng ta không thể phân lập và nuôi cấy được, và vì vậy không thể giải trình tự của chúng được. Những nghiên cứu đầu tiên của metagenomic tập trung vào đoạn trình tự của rRNA 16S (16S ribosomal RNA), là đoạn trình tự tương đối ngắn, bảo thủ và đặc trưng cho mỗi loài. Từ đó người ta đã phát hiện ra rất nhiều đoạn trình tự rRNA 16S mới, không giống bất cứ một loài đã biết nào. Những khảo sát về gen trên rRNA thực hiện trực tiếp từ môi trường đã cho thấy, số lượng loài vi khuẩn và vi khuẩn cổ (archaea) đã tìm thấy trước đây bằng phương pháp giải trình tự theo kiểu truyền thống chỉ tương đương khoảng 1% số lượng thực của chúng trong môi trường.

Những nghiên cứu đầu tiên ở mức độ phân tử đã được thực hiện bởi Norman R. Pace và các cộng sự. Họ sử dụng PCR để khám phá ra sự đa dạng của các trình tự rRNA.^[5] Với những kết quả của nghiên cứu này, vào năm 1985 Pace đã đề xuất ý tưởng nhân dòng DNA trực tiếp từ môi trường.^[6] Tới năm 1991 ông và cộng sự tại Khoa Sinh học, trường đại học Indiana đã có báo cáo đầu tiên về nhân dòng một lượng lớn DNA từ môi trường. Nghiên cứu của họ đã khẳng định rằng không hề có lỗi trong quá trình thực hiện PCR và những loài mới trong quần xã vi sinh vật là thực sự tồn tại. Mặc dù chỉ thực hiện với đoạn trình tự bảo thủ và không mã hóa, công trình trên đã chứng minh và giải thích tại sao các nghiên cứu về đa dạng sinh học trước đây bằng phương pháp hình thái học thường mang lại nhiều kết quả hơn so với phương pháp phân tích qua phân lập và nuôi cấy. Ngay sau đó, vào năm 1995 Healy đã công bố kết quả phân lập metagenomic của các gen chức năng trong “thư viện động vật” xây dựng từ hệ sinh vật tự nhiên trên cỏ khô trong phòng thí nghiệm.^[7] Sau khi rời phòng thí nghiệm của Pace, Edward DeLong tiếp tục nghiên cứu về lĩnh vực này và đã xuất bản công trình làm nền móng cho phân loại sinh vật môi trường dựa trên trình tự 16S, đó là thành lập thư viện trình tự của các mẫu lấy từ biển.^[8]

Vào năm 2002, Mya Breitbart, Forest Rohwer và các cộng sự đã sử dụng phương pháp shotgun sequencing để chứng minh rằng trong 200 lít nước biển có chứa trên 5000 loài virus khác nhau.^[9] Nghiên cứu sau đó đã tìm ra khoảng hơn 1000 loài virus trong phân người và khoảng 1 triệu virus trong mỗi kilogam trầm tích biển, trong đó có rất nhiều thể thực khuẩn. Năm 2004 Gene Tyson, Jill Banfield và cộng sự tại trường đại học California, Berkeley và Joint Genome Institute đã giải mã DNA từ mẫu môi trường bị axit hóa do khai khoáng (acid mine drainage, AMD).^[10] Nghiên cứu đã tìm ra một số nhóm vi khuẩn và vi khuẩn cổ mà trước đó chưa thể phân lập được.^[11]

Năm 2005, Stephan C. Schuster ở trường đại học Penn State University và các cộng sự đã công bố những trình tự đầu tiên giải bằng phương pháp hiện đại (kỹ thuật Pyrosequencing phát triển bởi 454 Life Sciences).^[12] Năm 2006 Robert Edward, Forest Rohwer và cộng sự ở San Diego State University cũng đã công bố thêm một công trình thuộc lĩnh vực này.^[13]

Giải trình tự

Phục hồi các đoạn trình tự DNA lớn hơn vài nghìn bp từ mẫu là việc làm rất khó và chỉ có thể thực hiện mới đây nhờ những tiến bộ trong kỹ thuật sinh học phân tử, cho phép ta thiết lập các thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (bacterial artificial chromosomes, BACs), tạo vector phục vụ cho việc nhân dòng.^[14]

Giải trình tự shotgun từ môi trường (Environmental Shotgun Sequencing, ESS). (A) Thu mẫu từ môi trường; (B) sàng lọc mẫu theo kích cỡ; (C) phân tích và phân lập DNA; (D) nhân dòng và lập thư viện; (E) giải trình tự các dòng (clones); (F) ghép nối trình tự (sequence assembly) để tạo thành các contig và scaffold.

Shotgun metagenomic

Nhờ các tiến bộ trong ngành tin sinh học, trong khuếch đại DNA và sự phát triển của công nghệ tính toán mà ta có thể phân tích các đoạn trình tự DNA từ các mẫu môi trường và ứng dụng giải trình tự shotgun cho các mẫu metagenomic. Có thể kể đến một số kết quả giải trình tự của vi sinh vật và của hệ gen người, ghép nối các đoạn DNA ngẫu nhiên ngắn thành các đoạn trình tự consensus. Giải trình tự shotgun và sàng lọc thư viện dòng cho biết các gen tồn tại trong mẫu môi trường. Nhờ vậy mà ta sẽ biết được loại sinh vật nào hay quá trình trao đổi chất nào đang diễn ra trong quần xã ^[15], từ đó có thể hiểu rõ hơn về sinh thái học và so sánh các mẫu môi trường với nhau.

Bên cạnh đó có thể dùng Shotgun metagenomic để giải trình tự gần như hoàn toàn hệ gen của vi sinh vật trực tiếp từ môi trường.^[10] Phân tích DNA của một mẫu thường cho kết quả là dữ liệu DNA của vi sinh vật có nhiều nhất trong mẫu. Để có được cái nhìn toàn diện hơn ta cần tìm cách giải trình tự bộ gen của các thành viên khác trong quần xã bằng cách phân tích một lượng mẫu lớn. Với giải trình tự shotgun ngẫu nhiên ta có thể phát hiện được các thành viên này ngay chỉ với các đoạn trình tự vô cùng nhỏ bé.^[10]

Giải trình tự hiện đại (High-throughput sequencing)

Những nghiên cứu metagenomic giải trình tự hiện đại đầu tiên đều được thực hiện bằng phương pháp 454 Pyrosequencing.^[12] Các kỹ thuật tiếp theo được ứng dụng là Giải trình tự Ion Torrent PGM, Phân tích genome Illumina và Hệ thống SOLiD.^[16] Bằng những kỹ thuật này ta chỉ đạt được các đoạn trình tự ngắn hơn so với phương pháp giải trình tự Sanger: các reads với IonTorrent PGM và 454 Pyrosequencing thường có độ dài khoảng 400 bp, với Illumina và SOLiD dài 25-75 bp ^[17], trong khi đó với phương pháp Sanger ta có các reads với độ dài khoảng 750 bp. Tuy vậy, để bù lại điều này, các phương pháp mới cho số lượng reads nhiều hơn hẳn so với phương pháp Sanger truyền thống: Pyrosequencing cho 200-500 megabases, Illumina cho khoảng 20-50 gigabase metagenome.^[18] Một ưu điểm nữa của giải trình tự đoạn ngắn (short-read) là các phương pháp này không đòi hỏi phải nhân dòng trước khi giải trình tự, vì vậy có thể duy trì được tính đa dạng của mẫu phân tích.

Tin sinh học – Bioinformatics

Dữ liệu của metagenomics thường rất lớn và tương đối nhiễu, vì nó chứa các mảnh dữ liệu của hàng chục ngàn loài sinh vật trong quần xã.^[19] Khi giải trình tự metagenome của dạ cỏ bò người ta đạt được dữ liệu chứa 279 gigabase (279 tỉ bp), và hệ quần xã ở ruột người có chứa các gen khoảng 3,3 triệu bp (sau khi đã ghép nối từ 567,7 gigabase dữ liệu).^[20] Chính vì thế việc thu thập và xử lý các dữ liệu này đã từ lâu trở thành thách thức không nhỏ cho các nhà nghiên cứu.^[15][21]

Bước đầu sàng lọc trình tự

Bước đầu tiên của phân tích dữ liệu metagenome đòi hỏi thực hiện một số bước lọc nhất định (loại bỏ chất tạp, các đoạn trình tự chất lượng kém và các trình tự (có thể) của sinh vật nhân chuẩn eukaryotes).^[22][23] Một số phương pháp loại bỏ trình tự DNA của sinh vật nhân chuẩn có thể kể đến phương pháp Eu-Detect và DeConseq.^[24][25]

Assembly (ghép các đoạn trình tự)

Có thể nói dữ liệu DNA từ metagenomic và từ genomic tương tự nhau, nhưng dữ liệu của các trình tự genomic cho tỉ lệ coverage cao trong khi dữ liệu metagenomic thường rất ít khi dư thừa.^[21] Hơn nữa với sự phát triển của công nghệ giải trình tự thế hệ mới (với kết quả dưới dạng các short-read) thì việc bị lỗi trong xử lý dữ liệu là điều rất dễ mắc phải. Như vậy việc ghép nối các đoạn trình tự của metagenomic thành các hệ gen sẽ rất rắc rối và khó tin cậy, đặc biệt khi lắp ghép các đoạn DNA lặp hay khi ghép các đoạn trình tự của các loài khác nhau thành một contig.

Phrap hay Celera Assembler là một số chương trình chỉ phục vụ cho ghép trình tự genomic, nghĩa là giải trình tự của một bộ gen riêng biệt, chứ không hiệu quả cho metagenomic.^[19] Một số chương trình khác như Velvet assembler đã được thiết kế tối ưu để lắp ghép các short-read nhờ sử dụng Bruijn graphs.

Dự đoán gen

Dự đoán gen của phân tích metagenomic sử dụng hai hướng tiếp cận trong việc chú thích (annotation) vùng mã hóa trong các contig đã được ghép nối trước đó. Hướng tiếp cận đầu tiên để phát hiện gen dựa trên sự tương đồng với các trình tự trong ngân hàng gen, thông thường bằng cách tìm kiếm BLAST. Hướng tiếp cận thứ hai là ab initio, dựa trên những đặc điểm bên trong mỗi đoạn trình tự để dự đoán vùng mã hóa dựa trên đơn vị gen đã biết của những sinh vật họ hàng. Có thể kể đến một số chương trình như MEGAN4 ^[26] phục vụ cho hướng thứ nhất và các GeneMark^[27] và GLIMMER phục vụ cho hướng thứ hai. Ưu điểm đầu tiên của dự đoán ab initio là nó cho phép dò các vùng mã hóa không có homolog tương đồng trên ngân hàng dữ liệu, tuy nhiên để phương pháp này thật chính xác thì cần có những đoạn DNA đủ lớn để so sánh.^[19]

Đa dạng loài

Việc chú thích gen giúp trả lời cho câu hỏi “cái gì”, trong khi việc xác định độ đa dạng loài giúp trả lời cho câu hỏi “ai”.^[28] Để xác định cấu trúc và chức năng của quần xã trong metagenomes, các đoạn trình tự phải được cố định hóa. Việc cố định này được hiểu là quá trình gắn một đoạn trình tự với một sinh vật cụ thể. Cố định hóa dựa trên sự tương đồng bao gồm các phương pháp như BLAST, được sử dụng để tìm kiếm marker hoặc các đoạn trình tự tương tự trong những dữ liệu có sẵn đã công bố. Theo cách này có thể sử dụng chương trình MEGAN.^[29] Một công cụ nữa để cố định hóa các reads là PhymmBL.^[19] Cố định hóa dựa trên thành phần tập trung vào đặc tính của các đoạn trình tự, như tần số của các oligonucleotide hoặc codon biểu hiện (codon usage bias).^[19] Sau khi phân nhóm các đoạn trình tự có thể phân tích so sánh độ đa dạng và phong phú của chúng nhờ một số chương trình khác, vd. như Unifrac.