Giải trình tự gen Metagenomics
Metagenomics là việc giải trình tự và phân tích DNA của các vi sinh vật lấy từ môi trường mà không cần nuôi cấy chúng. Metagenomics còn được biết đến như là “hệ gene cộng đồng” hay “hệ gene môi trường”.
Hiện nay, chúng ta có rất ít thông tin về đại đa số các vi sinh vật hiện diện trong các môi trường khác nhau trên trái đất, chủ yếu là do chúng ta không thể nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm – người ta ước lượng được rằng, dưới 1% của tất cả các loài vi khuẩn được nuôi cấy. Trong thời gian qua, chúng ta không nuôi cấy các vi sinh vật được là do thiếu kiến thức về sinh lý học của chúng và các tín hiệu môi trường mà dựa vào đó chúng ta có thể thiết kế môi trường nuôi cấy phù hợp, tuy nhiên các công nghệ nuôi cấy mới bắt đầu giải quyết những vấn đề này (Zengler, Walcher et al., 2005). Tuy nhiên, hầu hết tri thức của chúng ta được thu lượm từ một phần nhỏ vi sinh vật được phân lập. Nó giống như thầy bói mù sờ voi, sờ thấy chân voi thì bảo voi là cái cột.
Metagenomics cho phép chúng ta nghiên cứu các vi sinh vật bằng cách giải mã thông tin di truyền của chúng từ DNA mà được trích rút trực tiếp từ các cộng đồng của các vi sinh vật môi trường, do đó từng bước vượt qua sự cần thiết của việc phân lập hay nuôi cấy. Môn học này được xây dựng trên những thành công của các cuộc nghiên cứu 16S rRNA các mẫu môi trường nuôi cấy độc lập (Olsen, Lane et al., 1986). Nó cung cấp những hiểu biết về lịch sử tiến hóa cũng như các khả năng chưa biết từ trước của cộng đồng vi sinh vật chuyên sống trong môi trường. Đó là, các câu hỏi sau có thể được giải đáp “vi sinh vật nào ở đó?”, “vi sinh vật đang làm gì?” và “vi sinh vật hoạt động như thế nào?”. Kết quả phong phú của gene và cấu trúc phân tử được giải mã từ các vi sinh vật ko nuôi cấy được có tiềm năng to lớn trong sự phát triển chất xúc tác sinh học (biocatalysts) mới cho ứng dụng công nghiệp và dược phẩm.
Metagenomics là nghiên cứu về metagenomes, nhằm thu vật liệu di truyền trực tiếp từ các mẫu trong môi trường. Lĩnh vực rộng lớn này có thể được hiểu là di truyền học môi trường, di truyền học sinh thái hay di truyền học quần xã. Nếu như di truyền học và vi sinh vật học truyền thống giải trình tự bộ gen (genome sequencing) của vi sinh vật dựa trên mẫu là các mẫu dòng đã nuôi cấy, thì ngay từ những nghiên cứu đầu tiên, di truyền học môi trường đã nhân dòng các đoạn trình tự gen đặc hiệu (thường là gen 16S rRNA) để xây dựng dữ liệu về đa dạng sinh học của các mẫu môi trường. Với những nghiên cứu bước đầu đó, người ta đã nhận ra rằng nếu chỉ tiếp tục nghiên cứu theo kiểu truyền thống thì sẽ không thể tìm hiểu về sự đa dạng sinh học của vi sinh vật được.[1] Những nghiên cứu metagenomics gần đây thường thực hiện bằng phương pháp Sanger (“shotgun” Sanger sequencing), hoặc song song với phương pháp pyrosequencing để có các mẫu của tất cả các gen từ mỗi cá thể trong quần xã mẫu.[2] Chính vì vai trò quan trọng trong việc khám phá đa dạng vi sinh vật mà metagenomics có thể được coi như một lăng kính giúp ta hiểu hơn về thế giới của các sinh vật nhỏ bé.
Thuật ngữ “metagenomics” được giới thiệu bởi Jo Handelsman, Jon Clardy, Robert M. Goodman và một số người khác, và xuất hiện lần đầu trong một bài báo vào năm 1998.[3] Thuật ngữ metagenome phản ánh ý tưởng về bộ sưu tầm các gen được giải mã trực tiếp từ môi trường với cách tương tự như nghiên cứu về từng genome. Kevin Chen and Lior Pachter (University of California, Berkeley) đã định nghĩa metagenomics là ” việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong nghiên cứu về quần xã vi sinh vật một cách trực tiếp trong môi trường tự nhiên của chúng mà không cần phải phân lập và nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm”.[4]
Việc giải trình tự theo kiểu truyền thống thường bắt đầu bằng việc nuôi cấy các tế bào giống hệt nhau để làm nguồn phân lập DNA. Các nghiên cứu metagenomic đã cho thấy vẫn còn rất nhiều nhóm vi sinh vật trong tự nhiên mà chúng ta không thể phân lập và nuôi cấy được, và vì vậy không thể giải trình tự của chúng được. Những nghiên cứu đầu tiên của metagenomic tập trung vào đoạn trình tự của rRNA 16S (16S ribosomal RNA), là đoạn trình tự tương đối ngắn, bảo thủ và đặc trưng cho mỗi loài. Từ đó người ta đã phát hiện ra rất nhiều đoạn trình tự rRNA 16S mới, không giống bất cứ một loài đã biết nào. Những khảo sát về gen trên rRNA thực hiện trực tiếp từ môi trường đã cho thấy, số lượng loài vi khuẩn và vi khuẩn cổ (archaea) đã tìm thấy trước đây bằng phương pháp giải trình tự theo kiểu truyền thống chỉ tương đương khoảng 1% số lượng thực của chúng trong môi trường.
Những nghiên cứu đầu tiên ở mức độ phân tử đã được thực hiện bởi Norman R. Pace và các cộng sự. Họ sử dụng PCR để khám phá ra sự đa dạng của các trình tự rRNA.[5] Với những kết quả của nghiên cứu này, vào năm 1985 Pace đã đề xuất ý tưởng nhân dòng DNA trực tiếp từ môi trường.[6] Tới năm 1991 ông và cộng sự tại Khoa Sinh học, trường đại học Indiana đã có báo cáo đầu tiên về nhân dòng một lượng lớn DNA từ môi trường. Nghiên cứu của họ đã khẳng định rằng không hề có lỗi trong quá trình thực hiện PCR và những loài mới trong quần xã vi sinh vật là thực sự tồn tại. Mặc dù chỉ thực hiện với đoạn trình tự bảo thủ và không mã hóa, công trình trên đã chứng minh và giải thích tại sao các nghiên cứu về đa dạng sinh học trước đây bằng phương pháp hình thái học thường mang lại nhiều kết quả hơn so với phương pháp phân tích qua phân lập và nuôi cấy. Ngay sau đó, vào năm 1995 Healy đã công bố kết quả phân lập metagenomic của các gen chức năng trong “thư viện động vật” xây dựng từ hệ sinh vật tự nhiên trên cỏ khô trong phòng thí nghiệm.[7] Sau khi rời phòng thí nghiệm của Pace, Edward DeLong tiếp tục nghiên cứu về lĩnh vực này và đã xuất bản công trình làm nền móng cho phân loại sinh vật môi trường dựa trên trình tự 16S, đó là thành lập thư viện trình tự của các mẫu lấy từ biển.[8]
Vào năm 2002, Mya Breitbart, Forest Rohwer và các cộng sự đã sử dụng phương pháp shotgun sequencing để chứng minh rằng trong 200 lít nước biển có chứa trên 5000 loài virus khác nhau.[9] Nghiên cứu sau đó đã tìm ra khoảng hơn 1000 loài virus trong phân người và khoảng 1 triệu virus trong mỗi kilogam trầm tích biển, trong đó có rất nhiều thể thực khuẩn. Năm 2004 Gene Tyson, Jill Banfield và cộng sự tại trường đại học California, Berkeley và Joint Genome Institute đã giải mã DNA từ mẫu môi trường bị axit hóa do khai khoáng (acid mine drainage, AMD).[10] Nghiên cứu đã tìm ra một số nhóm vi khuẩn và vi khuẩn cổ mà trước đó chưa thể phân lập được.[11]
Năm 2005, Stephan C. Schuster ở trường đại học Penn State University và các cộng sự đã công bố những trình tự đầu tiên giải bằng phương pháp hiện đại (kỹ thuật Pyrosequencing phát triển bởi 454 Life Sciences).[12] Năm 2006 Robert Edward, Forest Rohwer và cộng sự ở San Diego State University cũng đã công bố thêm một công trình thuộc lĩnh vực này.[13]
Giải trình tự
Phục hồi các đoạn trình tự DNA lớn hơn vài nghìn bp từ mẫu là việc làm rất khó và chỉ có thể thực hiện mới đây nhờ những tiến bộ trong kỹ thuật sinh học phân tử, cho phép ta thiết lập các thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (bacterial artificial chromosomes, BACs), tạo vector phục vụ cho việc nhân dòng.[14]
Giải trình tự shotgun từ môi trường (Environmental Shotgun Sequencing, ESS). (A) Thu mẫu từ môi trường; (B) sàng lọc mẫu theo kích cỡ; (C) phân tích và phân lập DNA; (D) nhân dòng và lập thư viện; (E) giải trình tự các dòng (clones); (F) ghép nối trình tự (sequence assembly) để tạo thành các contig và scaffold.
Shotgun metagenomic
Nhờ các tiến bộ trong ngành tin sinh học, trong khuếch đại DNA và sự phát triển của công nghệ tính toán mà ta có thể phân tích các đoạn trình tự DNA từ các mẫu môi trường và ứng dụng giải trình tự shotgun cho các mẫu metagenomic. Có thể kể đến một số kết quả giải trình tự của vi sinh vật và của hệ gen người, ghép nối các đoạn DNA ngẫu nhiên ngắn thành các đoạn trình tự consensus. Giải trình tự shotgun và sàng lọc thư viện dòng cho biết các gen tồn tại trong mẫu môi trường. Nhờ vậy mà ta sẽ biết được loại sinh vật nào hay quá trình trao đổi chất nào đang diễn ra trong quần xã [15], từ đó có thể hiểu rõ hơn về sinh thái học và so sánh các mẫu môi trường với nhau.
Bên cạnh đó có thể dùng Shotgun metagenomic để giải trình tự gần như hoàn toàn hệ gen của vi sinh vật trực tiếp từ môi trường.[10] Phân tích DNA của một mẫu thường cho kết quả là dữ liệu DNA của vi sinh vật có nhiều nhất trong mẫu. Để có được cái nhìn toàn diện hơn ta cần tìm cách giải trình tự bộ gen của các thành viên khác trong quần xã bằng cách phân tích một lượng mẫu lớn. Với giải trình tự shotgun ngẫu nhiên ta có thể phát hiện được các thành viên này ngay chỉ với các đoạn trình tự vô cùng nhỏ bé.[10]
Giải trình tự hiện đại (High-throughput sequencing)
Những nghiên cứu metagenomic giải trình tự hiện đại đầu tiên đều được thực hiện bằng phương pháp 454 Pyrosequencing.[12] Các kỹ thuật tiếp theo được ứng dụng là Giải trình tự Ion Torrent PGM, Phân tích genome Illumina và Hệ thống SOLiD.[16] Bằng những kỹ thuật này ta chỉ đạt được các đoạn trình tự ngắn hơn so với phương pháp giải trình tự Sanger: các reads với IonTorrent PGM và 454 Pyrosequencing thường có độ dài khoảng 400 bp, với Illumina và SOLiD dài 25-75 bp [17], trong khi đó với phương pháp Sanger ta có các reads với độ dài khoảng 750 bp. Tuy vậy, để bù lại điều này, các phương pháp mới cho số lượng reads nhiều hơn hẳn so với phương pháp Sanger truyền thống: Pyrosequencing cho 200-500 megabases, Illumina cho khoảng 20-50 gigabase metagenome.[18] Một ưu điểm nữa của giải trình tự đoạn ngắn (short-read) là các phương pháp này không đòi hỏi phải nhân dòng trước khi giải trình tự, vì vậy có thể duy trì được tính đa dạng của mẫu phân tích.
Tin sinh học – Bioinformatics
Dữ liệu của metagenomics thường rất lớn và tương đối nhiễu, vì nó chứa các mảnh dữ liệu của hàng chục ngàn loài sinh vật trong quần xã.[19] Khi giải trình tự metagenome của dạ cỏ bò người ta đạt được dữ liệu chứa 279 gigabase (279 tỉ bp), và hệ quần xã ở ruột người có chứa các gen khoảng 3,3 triệu bp (sau khi đã ghép nối từ 567,7 gigabase dữ liệu).[20] Chính vì thế việc thu thập và xử lý các dữ liệu này đã từ lâu trở thành thách thức không nhỏ cho các nhà nghiên cứu.[15][21]
Bước đầu sàng lọc trình tự
Bước đầu tiên của phân tích dữ liệu metagenome đòi hỏi thực hiện một số bước lọc nhất định (loại bỏ chất tạp, các đoạn trình tự chất lượng kém và các trình tự (có thể) của sinh vật nhân chuẩn eukaryotes).[22][23] Một số phương pháp loại bỏ trình tự DNA của sinh vật nhân chuẩn có thể kể đến phương pháp Eu-Detect và DeConseq.[24][25]
Assembly (ghép các đoạn trình tự)
Có thể nói dữ liệu DNA từ metagenomic và từ genomic tương tự nhau, nhưng dữ liệu của các trình tự genomic cho tỉ lệ coverage cao trong khi dữ liệu metagenomic thường rất ít khi dư thừa.[21] Hơn nữa với sự phát triển của công nghệ giải trình tự thế hệ mới (với kết quả dưới dạng các short-read) thì việc bị lỗi trong xử lý dữ liệu là điều rất dễ mắc phải. Như vậy việc ghép nối các đoạn trình tự của metagenomic thành các hệ gen sẽ rất rắc rối và khó tin cậy, đặc biệt khi lắp ghép các đoạn DNA lặp hay khi ghép các đoạn trình tự của các loài khác nhau thành một contig.
Phrap hay Celera Assembler là một số chương trình chỉ phục vụ cho ghép trình tự genomic, nghĩa là giải trình tự của một bộ gen riêng biệt, chứ không hiệu quả cho metagenomic.[19] Một số chương trình khác như Velvet assembler đã được thiết kế tối ưu để lắp ghép các short-read nhờ sử dụng Bruijn graphs.
Dự đoán gen
Dự đoán gen của phân tích metagenomic sử dụng hai hướng tiếp cận trong việc chú thích (annotation) vùng mã hóa trong các contig đã được ghép nối trước đó. Hướng tiếp cận đầu tiên để phát hiện gen dựa trên sự tương đồng với các trình tự trong ngân hàng gen, thông thường bằng cách tìm kiếm BLAST. Hướng tiếp cận thứ hai là ab initio, dựa trên những đặc điểm bên trong mỗi đoạn trình tự để dự đoán vùng mã hóa dựa trên đơn vị gen đã biết của những sinh vật họ hàng. Có thể kể đến một số chương trình như MEGAN4 [26] phục vụ cho hướng thứ nhất và các GeneMark[27] và GLIMMER phục vụ cho hướng thứ hai. Ưu điểm đầu tiên của dự đoán ab initio là nó cho phép dò các vùng mã hóa không có homolog tương đồng trên ngân hàng dữ liệu, tuy nhiên để phương pháp này thật chính xác thì cần có những đoạn DNA đủ lớn để so sánh.[19]
Đa dạng loài
Việc chú thích gen giúp trả lời cho câu hỏi “cái gì”, trong khi việc xác định độ đa dạng loài giúp trả lời cho câu hỏi “ai”.[28] Để xác định cấu trúc và chức năng của quần xã trong metagenomes, các đoạn trình tự phải được cố định hóa. Việc cố định này được hiểu là quá trình gắn một đoạn trình tự với một sinh vật cụ thể. Cố định hóa dựa trên sự tương đồng bao gồm các phương pháp như BLAST, được sử dụng để tìm kiếm marker hoặc các đoạn trình tự tương tự trong những dữ liệu có sẵn đã công bố. Theo cách này có thể sử dụng chương trình MEGAN.[29] Một công cụ nữa để cố định hóa các reads là PhymmBL.[19] Cố định hóa dựa trên thành phần tập trung vào đặc tính của các đoạn trình tự, như tần số của các oligonucleotide hoặc codon biểu hiện (codon usage bias).[19] Sau khi phân nhóm các đoạn trình tự có thể phân tích so sánh độ đa dạng và phong phú của chúng nhờ một số chương trình khác, vd. như Unifrac.
